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Immunology and Infection

चिकित्सीय एंटीबॉडी के बीच लक्ष्य बाध्यकारी और सीडीसी प्रेरण की तुलना करने के लिए विट्रो विधि में: बायोसमिलाइटी विश्लेषण में अनुप्रयोग

Published: May 4, 2017 doi: 10.3791/55542
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 4,5, 6
1Unit for Development and Research in Bioprocesses Unit (UDIBI), National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute (IPN), University of Mexico (UNAM), 2School of Chemistry, National Autonomous University of Mexico (UNAM), 3Graduate Program in Chemical Sciences, National Autonomous University of Mexico (UNAM), 4Unit for Development Research and Medical Innovation in Biotechnology (UDIMEB), National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute (IPN), 5Department of Immunology, National Scool of Biological Sciences, National Polytechnic Institute (IPN), 6Department of Pharmacology and Unit of Translational Biomedicine (CMN 20 de noviembre), School of Medicine, National Autonomous University of Mexico (UNAM)

Summary

यह प्रोटोकॉल का वर्णन करता है rituximab के दो प्रमुख कार्यात्मक विशेषताओं के इन विट्रो तुलना: लक्ष्य बंधन और पूरक पर निर्भर cytotoxicity (सीडीसी) प्रेरण। तरीकों संदर्भ rituximab और एक rituximab biosimilar के बीच एक पक्ष को साइड तुलना के लिए कार्यरत थे। ये assays biosimilar विकास के दौरान या उनके उत्पादन में एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में नियोजित किया जा सकता।

Abstract

चिकित्सीय मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) कैंसर सहित विभिन्न रोगों के उपचार के लिए प्रासंगिक हैं। फार्मास्युटिकल कंपनियों द्वारा बायोसिमिलर एमएबी का विकास बाजार का मौका है, लेकिन यह ड्रग की पहुंच बढ़ाने और चिकित्सा से जुड़ी लागत को कम करने की भी एक रणनीति है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल दाडी कोशिकाओं में रिटुकसीमाब द्वारा लक्ष्य बाध्यकारी और सीडीसी शामिल करने के मूल्यांकन का वर्णन करते हैं। इन दो कार्यों को एंटीबॉडी के विभिन्न संरचनात्मक क्षेत्रों की आवश्यकता होती है और यह राइटक्सेमब द्वारा प्रेरित नैदानिक ​​प्रभाव से संबंधित होती है। प्रोटोकॉल एक संदर्भ rituximab और एक बाजार rituximab biosimilar की ओर से साइड तुलना की अनुमति देते हैं। मूल्यांकन किए गए उत्पादों ने लक्ष्य बाध्यकारी और सीडीसी शामिल करने में दोनों मतभेदों को दिखाया, यह बताते हुए कि भौतिक भौतिक अंतर हैं और नैदानिक ​​सेटिंग में उन मतभेदों के प्रभाव का विश्लेषण करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला जा रहा है। यहां रिपोर्ट किए गए तरीके इन विट्रो <में सरल और सस्ती हैं/ Em> rituximab biosimilars की गतिविधि के मूल्यांकन के लिए मॉडल इस प्रकार, वे बायोसिमilar विकास के दौरान उपयोगी हो सकते हैं, साथ ही बायोसिमिअर उत्पादन में गुणवत्ता नियंत्रण के लिए भी। इसके अलावा, प्रस्तुत पद्धतियां अन्य उपचारात्मक एमएबी के लिए एक्सट्रपोलोटेड हो सकती हैं।

Introduction

चिकित्सीय एंटीबॉडी पुनः संयोजक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) हैं जो कि विभिन्न रोगों के उपचार के लिए विकसित होते हैं, जिनमें कैंसर, ऑटोइम्यून और पुरानी बीमारियां, तंत्रिका संबंधी विकार और अन्य 1 शामिल हैं । वर्तमान में, एफडीए ने 40 से अधिक चिकित्सीय एमएबी को मंजूरी दे दी है, और अगले कुछ वर्षों में बाजार तक पहुंचने की उम्मीद है।

रिट्क्सिमैब सीडी 20 + बी सेल नॉन-हॉजकिन के लिंफोमा (एनएचएल), सीडी 20 + कूपिक्युलर एनएचएल, क्रोनिक लिम्फोसाइटैटिक ल्यूकेमिया, और रुमेटीयस गठिया 2 , 3 के इलाज के लिए अनुमोदित एक उच्च-संबंधता चिड़चिड़ा मोनोक्लोनल आईजीजी 1 एंटीबॉडी है। सीडी 20 की मान्यता, जो बी कोशिकाओं में अतिसंवेदनशील है, द्वारा rituximab एपोपोसिस लाती है; सक्रियण पूरक; और एंटीबॉडी-आश्रित सेल मध्यस्थताय साइटोटॉक्सिसिटी (एडीसीसी) 3 इस दवा का पेटेंट 2013 और 2016 में यूरोप और अमेरिका में समाप्त हो गयाक्रमश। इस प्रकार, दवा कंपनियों के लिए दुनिया भर rituximab biosimilars विकसित कर रहे हैं। मानव उपभोग के लिए किसी अन्य दवा के रूप में, biosimilars नियामक एजेंसियों से अनुमोदन की आवश्यकता है। अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों संकेत मिलता है कि Mabs के लिए, biosimilarity भौतिक विशेषताओं, फार्माकोकाइनेटिक्स, प्रभावकारिता, और नए और संदर्भ उत्पादों 4 की सुरक्षा की तुलना द्वारा प्रदर्शन किया जाना चाहिए।

तदनुसार, इस तरह की तुलना में इस्तेमाल के तरीके Mabs के संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं, विशेष रूप से नैदानिक ​​प्रासंगिकता के साथ उन लोगों का आकलन करना चाहिए। इसके लिए इन विट्रो assays इन विवो प्रयोगों तुलना में अधिक लाभ (। फेरीवाला एट अल में समीक्षा) 5 दिखाने: i) इन विट्रो अध्ययनों प्रस्तावित biosimilar और संदर्भ उत्पाद के बीच अंतर करने के लिए अधिक संवेदनशील होते हैं; ii) विवो अध्ययन में प्रासंगिक प्रजातियों, जो कई Mabs के लिए कर रहे हैं किया जाना चाहिएगैर मानव प्राइमेट; और iii) क्रिया के तंत्र के बाद से, प्रीक्लेक्निकल विष विज्ञान और संदर्भ उत्पाद के नैदानिक ​​प्रभावों को अच्छी तरह से जाना जाता है, क्योंकि बायोसिमिलर के साथ विवो अध्ययन में अतिरिक्त उपयोगी जानकारी प्रदान नहीं की जा सकती है। तदनुसार, बायोसिमिलर के लिए यूरोपीय संघ का मार्गदर्शन उम्मीदवारों को अकेले इन विट्रो डेटा में मजबूत आधार पर क्लीनिकल परीक्षणों में प्रवेश करने की अनुमति देता है।

यहां, हम दो तेज, आर्थिक और सरल एहसास प्रस्तुत करते हैं जो कि सीडी 20 + सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करते हुए rituximab की जैविक गतिविधि का मूल्यांकन करते हैं। इन assays rituximab biosimilar उम्मीदवारों के लिए तुलनात्मकता व्यायाम के हिस्से के रूप में शामिल किया जा सकता है।

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Protocol

1. लक्ष्य का मूल्यांकन प्रवाह cytometry द्वारा बाइंडिंग

  1. जैविक सामग्री और अभिकर्मकों की तैयारी
    1. 500 एमएल RPMI के संवर्धन माध्यम में 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एच IFBS) के साथ पूरक सुनिश्चित करें।
    2. संस्कृति दौदी बर्किट का लिंफोमा (Daudi) कोशिकाओं और Daudi GFP + कोशिकाओं RPMI और 75 सेमी 2 संस्कृति बोतल का उपयोग कर। एक 5% सीओ 2 humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों का रखरखाव, जब तक वे 6 तक पहुँचने - 9 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल।
    3. कमजोर पीबीएस में 1/100 एच IFBS द्वारा धुंधला बफर के 50 एमएल करते हैं; कम से कम एक महीने के लिए 8 डिग्री सेल्सियस - इस बफर 2 पर स्थिर है।
    4. संदर्भ और biosimilar Mabs के लिए परीक्षण समाधान तैयार करें। बफर धुंधला, 5 माइक्रोग्राम / एमएल से शुरू में 2 धारावाहिक dilutions (500 μL प्रत्येक): दस 1 बनाओ।
    5. चोर को / एमएल और पीई Cy5 माउस विरोधी मानव आईजीजी (माध्यमिक एंटीबॉडी) 5 माइक्रोग्राम के लिए मानव आईजीजी (isotype नियंत्रण) को कमजोर करने धुंधला बफर का प्रयोग करेंcentration निर्माता द्वारा सुझाए गए।
    6. पीबीएस (निर्धारण बफर) में 4% paraformaldehyde तैयार करें।
  2. लक्ष्य बाध्यकारी
    1. 75 सेमी 2 संस्कृति बोतल से Daudi और Daudi GFP + सेल निलंबन इकट्ठा करने और उन्हें एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण। 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
    2. पीबीएस के 5 एमएल जोड़ने और 5 मिनट के लिए 400 XG पर सेल निलंबन centrifuging कोशिकाओं को धो लें।
    3. पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend और एक कोशिका गिनती और trypan नीले रंग के साथ व्यवहार्यता विश्लेषण करते हैं। सेल व्यवहार्यता के स्तर के साथ संस्कृतियों का उपयोग विश्लेषण के लिए 95% ≥।
    4. 4 x 10 6 कोशिकाओं ठंड धुंधला बफर के साथ / एमएल के लिए सेल निलंबन पतला।
    5. 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में, संदर्भ या biosimilar Mabs के विभिन्न परीक्षण सांद्रता के 100 μL करने के लिए सेल निलंबन के 50 μL जोड़ें। प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए प्रतिकृति को शामिल करें।
    6. के लिए अतिरिक्त ट्यूबों तैयार करेंisotype नियंत्रण (rituximab के बजाय मानव IgG1) और नकारात्मक नियंत्रण (प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना माध्यमिक एंटीबॉडी)।
    7. 30 मिनट - 20 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    8. पीबीएस के 1 एमएल जोड़ने और 10 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर सेल निलंबन centrifuging कोशिकाओं को धो लें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    9. माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 μL में कोशिकाओं को निलंबित और 20 के लिए सेते हैं - 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के प्रकाश से संरक्षित किया।
    10. कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धो लें और उन्हें निर्धारण बफर के 200 μL में रोक देते हैं।
    11. एक प्रवाह कोशिकामापी पर कोशिकाओं का विश्लेषण करें।
      नोट: संकेत कई दिनों के लिए स्थिर बनी हुई है नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और प्रकाश से संरक्षित कर रहे हैं।
  3. आंकड़ा अधिग्रहण
    1. ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर कोशिकामापी प्रवाह के एक कार्यपत्रक पर दो डॉट भूखंडों खुला। पहली और एफएससी-ए बनाम दूसरे में सर्व शिक्षा अभियान-ए में बनाम FSC-एच एफएससी-ए सेट करें। पीई Cy5 चैनल के लिए एक हिस्टोग्राम खोलें।
    2. एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच प्लॉट में, गेट इवेंट्स ( चित्रा 1 ए ) का चयन करने के लिए एक गेट (आर 1) बनाएं।
    3. एफएससी-ए बनाम एसएसए-ए डॉट-प्लॉट में आर 1 की जनसंख्या निर्धारित करें और फिर लक्ष्य कोशिकाओं का चयन करें ( चित्रा 1 बी ) का चयन करें। कोशिकाओं के आवृत्ति वितरण को देखने के लिए पीई-साइ 5 तीव्रता हिस्टोग्राम में आर 2 आबादी को निर्धारित करें।
    4. नकारात्मक और आइसोटाइप नियंत्रण ( चित्रा -1 सी ) का उपयोग करके पीई-साइ -5 चैनल के लिए निचला प्रतिदीप्ति तीव्रता (FI) सीमा को समायोजित करें।
    5. संदर्भ उत्पाद की उच्च एकाग्रता के साथ नमूना से आर 2 के भीतर 10,000 घटनाएं प्राप्त करें। इस नमूने की FI अधिकतम उम्मीद की जानी चाहिए ( चित्रा -1 सी )।
    6. शेष नमूनों को प्राप्त करें
    7. प्रत्येक नमूने के लिए, पीई साइरियन चैनल में औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) प्राप्त करें।
    8. संदर्भ या बायोसिमिलर एमएबी के नमूनों के लिए, नमूना एमएफआई और आइसोटाइप कंट्रोल (Δ एमएफआई) के बीच अंतर की गणना करें।

2. सीडीसी का आकलन

  1. जैविक सामग्री और अभिकर्मकों की तैयारी
    1. सेल संस्कृति माध्यम और संस्कृति डादी और दाडी जीएफपी + कोशिकाओं को ऊपर वर्णित के रूप में तैयार करें (चरण 1.1.1 - 1.1.2)।
      नोट: इसके अतिरिक्त, सीडीसी परख सीरम मुक्त आरपीएमआई की आवश्यकता है
    2. सीरम मुक्त आरपीएमआई के साथ सामान्य मानव सीरम पूरक (एनएचएससी) 1: 2 पतला। 2.5 एमएल तैयार करें
    3. 1 एमएल की गर्मी निष्क्रिय (30 मिनट / 56 डिग्री सेल्सियस) तैयार करें एनएचएससी ने आरपीएमआई के साथ 1: 2 पतला।
    4. सीरम मुक्त आरपीएमआई में संदर्भ और बायोसिमिलर एमएबी के लिए परीक्षण समाधान तैयार करें। 1 से 0.025 माइक्रोग्राम / एमएल तक दस मंथन (200 μL प्रत्येक) बनाओ
  2. सीडीसी परख
    1. संस्कृतियों से दाडी और दाडी जीएफपी + कोशिकाओं को एकत्रित करें और सेल व्यवहार्यता को मापें (चरण 1.2.1 - 1.2.3 देखें)।
    2. सीरम मुक्त आरपीएमआई में 4 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के साथ सेल निलंबन तैयार करें।
    3. जोड़ना50 सेल microplates -bottom 96-अच्छी तरह शंक्वाकार (वी) में प्रत्येक संदर्भ या biosimilar mAb परीक्षण एकाग्रता के 50 μL के निलंबन की μL। प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए प्रतिकृति को शामिल करें।
    4. अतिरिक्त कुओं नकारात्मक नियंत्रण के लिए (यानी, mAb के बिना), बेसल मौत नियंत्रण तैयार (यानी, गर्मी निष्क्रिय mAb की उपस्थिति में NHSC), और धुंधला सकारात्मक नियंत्रण (यानी, 70% के 50 μL EtOH के संपर्क में कोशिकाओं)।
    5. एक 5% सीओ 2 humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट - 20 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    6. करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से और एक 5% सीओ 2 humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 घंटे के लिए opsonized कोशिकाओं सेते: 50 NHSC की μL जोड़ें (2 1 पतला)। बेसल मौत नियंत्रण कुओं में गर्मी निष्क्रिय NHSC का प्रयोग करें।
    7. 10 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    8. पीबीएस के 150 μL जोड़ने और 400 XG में 5 मिनट और 10 डिग्री सेल्सियस के लिए सेल निलंबन centrifuging कोशिकाओं को धो लें। डिसतह पर तैरनेवाला सूखा
    9. 7-एमीनोएक्टिनोमाइसिन (7-एएडी) वाले नमूनों को दाग़ी, जैसा कि पहले वर्णित है 7 , 8
    10. उसी दिन एक प्रवाह cytometer पर कोशिकाओं का विश्लेषण करें।
  3. आंकड़ा अधिग्रहण
    1. फ्लो साइटोमीटर ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर के कार्यपत्रक पर दो डॉट-प्लॉट खोलें। चरण 1.3.1 - 1.3.3 ( चित्रा 2 ए-बी ) के रूप में उन भूखंडों को निर्धारित करें। आर 2 जनसंख्या पर जीएपीपी बनाम 7-एएडी के लिए एक तीसरी साजिश है जो एक डॉट-प्लॉट बनाएं
    2. दाडी कोशिकाओं, दादी जीएफपी + कोशिकाओं, और मौत के सकारात्मक नियंत्रण ( चित्रा 2 सी ) का उपयोग करके पर्याप्त FI सीमाओं को परिभाषित करें।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए, 7-एएडी + लक्ष्य कोशिकाओं का प्रतिशत मापें। R2 से कम से कम 5,000 ईवेंट प्राप्त करें
    4. 7-एएडी + के प्रतिशत को घटाकर विशिष्ट मौब-प्रेरित साइटोटेक्सिसिटी की गणना करें, जो बेसल मृत्यु नियंत्रण में अलग-अलग नमूने में पाए गए प्रतिशत से प्राप्त होते हैंएमएबी के एन्टी सांद्रता ( चित्रा 2 डी )

3. बायोसाइमरिलिटी विश्लेषण

  1. ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर में एकाग्रता और प्रतिक्रिया मूल्य दर्ज करें
  2. ग्राफ़ उत्पन्न करें और निम्न विचारों के साथ गैर-रेखीय प्रतिगमन की गणना करें: i) "एक्स" के रूप में मैब एकाग्रता के लॉग-ट्रांसफॉर्म का उपयोग करें; Ii) चर ढलान गणितीय मॉडल (वाई = न्यूनतम प्रतिक्रिया + (अधिकतम प्रतिक्रिया - न्यूनतम प्रतिक्रिया) / 1 + 10 ^ ((LogEC 50- X) * हिल ढाल) का उपयोग करें; और iii) नीचे के मूल्यों को शून्य पर रोकना, चूंकि मूल प्रतिक्रिया को घटाया गया है।
    नोट: एक सममित सिगॉलाइड आकार के साथ घटता उम्मीद की जाती है।
  3. एक गैर-रैखिक दोनों की तुलना एक एफ-परीक्षण (कई ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर प्रोग्रामों में शामिल हैं) का उपयोग करके एक वैश्विक फिट के साथ फिट बैठता है।
    नोट: इस तरह के परीक्षणों में अशक्त परिकल्पना के रूप में स्थापित किया गया है कि अधिकतर प्रतिक्रिया, लॉगईसी 50 , और हिल ढलान दोनों डेटासेट के समान हैं, जो इससे मेल खाता हैजैविक सवाल का समाधान करने का इरादा है।

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Representative Results

ऊपर बताए गए प्रोटोकॉल का उपयोग, बाध्यकारी लक्ष्य और संदर्भ रितुक्सिमैब के सीडीसी को शामिल करने की तुलना एशिया में उत्पादित और व्यावसायिक तौर पर उपलब्ध बायोसिंमर रिट्क्सिमैब के समान की तुलना में की गई थी।

दाडी कोशिकाओं में, एमएएसबी दोनों एक एकाग्रता-निर्भर तरीके से ( चित्रा 1 डी ) में सीडी 20 बाँधते हैं। बाध्यकारी डेटा के गैर-रेखीय प्रतिगमन क्रमशः संदर्भ और बायोसिंमर रितुक्सिमैब के लिए 0.978 और 0.848 के एक 2 को प्रदर्शित करता है ( चित्रा 1 ई )। एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता के सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि वे, और इसलिए उन से गणना फार्माकोडायनेमिक मापदंड, mAbs (पी <0.0001) के बीच काफी भिन्न हैं। जैवइमर के लिए अधिकतम प्रतिक्रिया संदर्भ उत्पाद से 2.16 गुना कम थी। इन परिणामों से पता चलता है कि दो मूल्यांकन किए गए mAbs में सीडी 20 को बाँधने के लिए अलग-अलग क्षमताएं हैं Iल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं के mbrane।

सीडीसी प्रेरण भी दो Mabs की तुलना में था। संदर्भ और biosimilar उत्पादों को एक एकाग्रता पर निर्भर ढंग (चित्रा 2 ई) में Daudi कोशिकाओं में सीडीसी को प्रेरित किया। महत्वपूर्ण रूप से, सांद्रता, जिस पर प्रेरित MABS सीडीसी लक्ष्य बाध्यकारी के लिए आवश्यक उन से अलग थे। सीडीसी डेटा की गैर रेखीय प्रतिगमन दोनों उत्पादों के लिए आर 2> 0.980 दिखाया। एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता के सांख्यिकीय तुलना संकेत दिया कि वे काफी अलग (पी <0.01) कर रहे हैं, biosimilar कम शक्तिशाली बना रही है। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि सीडीसी प्रेरित करने के लिए क्षमता का विश्लेषण किया Mabs के लिए अलग है।

आकृति 1
चित्र 1 इन विट्रो में विरोधी CD20 चिकित्सीय Mabs का लक्ष्य बाध्यकारी। Daudi GFP + कोशिकाओं अलग से अवगत करायाएमएबी (4.8 एनजी / एमएल से 5 माइक्रोग्राम / एमएल) की एंट सांद्रता और फिर पीई-साइ -5-संयुग्मित एंटी-मानव माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग आती है। प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफआई) को सिंगल इवेंट (ए) पर फ्लो साइटोमैट्री द्वारा मापा जाता है, जिसमें दाडी कोशिकाओं (बी) के आकार और ग्रैन्युलैरिटी होती है। अस्थिर कोशिकाओं (हल्के भूरे रंग), आइसोटाइप नियंत्रण (गहरे भूरे रंग), और संदर्भ के 5 μg / mL rituximab (नीला) FI सीमा (सी) सेट करने के लिए नियोजित थे। दोनों एकाग्रता-निर्भर तरीके (डी) में एमएबीएस बाउंड ड्यूडी कोशिकाओं का मूल्यांकन किया। उत्तर (संदर्भ के लिए ΔMFI; देखें टेक्स्ट) का प्रयोग संदर्भ (नीला) या बायोसिमिलर (काला) रिट्यूक्सिमैब (ई) के लिए एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता उत्पन्न करने के लिए किया गया था। गैर-रेखीय प्रतिगमन के सांख्यिकीय तुलना में एमएबी (पी <0.0001; फिशर सटीक परीक्षण) के बीच अंतर दिखाई देता है। कृपया एक बड़ी वाणी देखने के लिए यहां क्लिक करेंइन आंकड़ों की पर।

चित्र 2
चित्रा 2. सीडीसी विरोधी CD20 चिकित्सीय MABS से प्रेरण। Mabs के विभिन्न सांद्रता के साथ opsonized Daudi GFP + कोशिकाओं मानव पूरक के संपर्क में आए। कोशिका मृत्यु 7-एएडी धुंधला और एकल घटनाओं (ए), आकार और विवरण के स्तर को Daudi कोशिकाओं (बी) के लिए इसी के साथ पर प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफआई) के प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया गया था। बेदाग GFP- (काला) और GFP + (हरा) कोशिकाओं और इथेनॉल मारे कोशिकाओं (लाल) के रूप में नियंत्रण (सी) शामिल थे। 7-एएडी + बेसल-मौत नियंत्रण (ग्रे) और rituximab नमूने (नीला) में कोशिकाओं mAb प्रेरित cytotoxicity (डी) की गणना के लिए अनुमति की मात्रा। एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता संदर्भ (नीला) या biosimilar (काला) rituximab के लिए प्राप्त की (ई)। गैर-रेखीय प्रतिगमन की सांख्यिकीय तुलना में दो एमएबी (पी <0.01; फिशर सटीक परीक्षण) द्वारा प्रेरित प्रतिक्रियाओं के बीच अंतर दिखाई दिया। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

तालिका एक
तालिका 1. सीडीसी परख के लिए लक्षित कोशिकाओं के साथ चिकित्सीय उपयोग के लिए स्वीकृत मोनोक्लोनल एंटीबॉडी। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

एक चिकित्सीय एमएबी पेटेंट की समाप्ति बायोसिमिलर के विकास को बढ़ावा दे रही है। इस प्रकार, सरल तरीकों की आवश्यकता है जो इन उत्पादों के नैदानिक ​​रूप से प्रासंगिक गतिविधियों में अंतर को पहचान सकती हैं। सीडी 20 + सुसंस्कृत कोशिकाओं को रिट्क्सिमैब की दो प्रमुख कार्यात्मक विशेषताओं के मूल्यांकन के लिए नियोजित किया गया था: लक्ष्य बंधन और सीडीसी शामिल। पूर्व गतिविधि को एमएबी के फैब क्षेत्र द्वारा सीडी 20 की पहचान की आवश्यकता है, जबकि बाद में मुख्य रूप से एफसी क्षेत्र के संपर्क में 9 पूरक हैं इसलिए, इन assays mAbs के संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं को जोड़ने का एक तरीका प्रदान करते हैं।

चिकित्सीय एमएबी का लक्ष्य बाध्यकारी आमतौर पर इओस्पेरामल टिटेटेशन कैलोरीमेट्री (आईटीसी), सोल्यूस प्लसॉन रेज़ोनेंस (एसपीआर), या बिओएयर इंटरफेरोमेट्री 10 , 11 , 12 द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। इन assays अनुमतिfinity गणना, लेकिन किसी विशेष उपकरण और प्रशिक्षण की आवश्यकता है। प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित एक तरफ करने के लिए पक्ष की तुलना में बाध्यकारी भले ही वह संबंध डेटा के बिना, उत्पादों के बीच मतभेद की पहचान करने के लक्ष्य का मूल्यांकन करता है। विधि सरल है और गतिविधि के मूल्यांकन के लिए प्रासंगिक सेलुलर संदर्भ कार्यरत हैं। दूसरी ओर, सीडीसी प्रेरण rituximab द्वारा एटीपी माप 13 से मूल्यांकन किया जा सकता, जारी लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) की मात्रा 14 या alamarBlue 15, और MTT assays 16। विधि यहाँ सूचना दी, 7-एएडी धुंधला का उपयोग कर, एक कम पृष्ठभूमि है और multiparametric प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए अन्य दाग के साथ जोड़ा जा सकता है।

प्रस्तुत प्रतिनिधि प्रयोगों में, खुराक-प्रतिक्रिया घटता चार पैरामीटर सैन्य मॉडल फिट, चुनाव आयोग 50 की गणना, हिल ढाल, और अधिक से अधिक प्रतिक्रिया के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से, concentrati की सीमाओंप्रारंभिक प्रयोगों में पर्याप्त श्रेणियों का विश्लेषण और परिभाषित करने के महत्व को उजागर करते हुए, इस तरह के घटता उत्पन्न करने के लिए नियोजित ऑन्स प्रत्येक परख के लिए अलग थे। प्रमुख अभिकर्मकों में परिवर्तन, जैसे फ्लोरोरेम्रोम और पूरक, या एक अलग लक्ष्य स्तर के साथ एक सेल लाइन के उपयोग, सांद्रता की प्रभावी श्रृंखला को विस्थापित कर सकते हैं।

सांख्यिकीय विश्लेषण ने एशिया और संदर्भ उत्पाद में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बायोसिंमर रिट्क्सिमब के एक बैच के बीच अंतर को पहचान लिया, दोनों लक्ष्य बाध्यकारी और सीडीसी शामिल में। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि, जब भी एमएबी के निर्माण की प्रक्रिया कसकर नियंत्रित होती है, संदर्भ उत्पाद के प्रत्येक विशेषता एक श्रेणी को दर्शाती है। तदनुसार, एक समान बायोथेरेप्यूटिक के मूल्यांकन के दौरान न्यूनतम बैचों की जांच की जानी चाहिए संदर्भ उत्पाद की परिवर्तनशीलता और परख परिवर्तनशीलता पर निर्भर करता है 4 .इस प्रकार, इन प्रोटोकॉल को अलग-अलग पर लागू किया जाना चाहिएतुलनीयता के मूल्यांकन के दौरान NT बैचों।

प्रस्तुत तरीकों चिकित्सकीय MABS-लक्ष्य के अन्य जोड़े के लिए वाग्विस्तार किया जा सकता है, जब तक कि कोशिकाओं प्रतिजन व्यक्त सुलभ हैं। तालिका 1 सूचियों चिकित्सकीय rituximab जिसके लिए सीडीसी प्रेरण नैदानिक प्रभावकारिता के लिए प्रासंगिक है और प्रत्येक mAb के लिए पहले से सूचना दी सेलुलर मॉडल के बारे में जानकारी संकलित की तुलना में अन्य MABS।

अंत में, यहाँ वर्णित दो assays सबसे प्रयोगशालाओं में उनके निष्पादन के लिए अनुमति देता है, सरल, तेज, और कम खर्चीली हैं। तरीकों biosimilar विकास के प्रारंभिक चरणों के दौरान या बैच करने वाली बैच उत्पादन के दौरान तुलना के लिए नियामक मंजूरी के बाद इस्तेमाल किया जा सकता।

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Disclosures

एन। सलीनास-जाज़िन, ई। गोंजालेज़-गोंजालेज, और एस.एम. पेरेज़-तापिया, यूडीबीआई के कर्मचारी हैं, जो कई दवा कंपनियों के लिए बायोसिमिलिटा अध्ययन करती हैं।

Acknowledgments

लेखकों कोई स्वीकृतियां की है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001 Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution Sigma T8154 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells ATCC CCL-213 You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 16000-044 You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement Quidel A113 It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D BDPharmigen 559925 You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG BDPharmigen 551497 Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer
Human IgG Isotype Control ThermoFisher Scientific 07-7102 Change depending to mAb
BDCytofix BDPharmigen 554655 Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) GIBCO 70011-044 Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom Corning 29442-068 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab) Roche — Reference product
Rituximab Indian — Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes Corning 430290 or 430052 —
Pipette Tips Eppendorf — Multiple volume configurations are necessary
Pipettes Eppendorf — Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model Eppendorf — Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer BD Dickinson — BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope Olympus — To quantify and evaluate cell growth
Incubator SANYO — Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet CHC BIOLUS — Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 123 रिट्क्सिमैब बायोसिमिलर एडीडी-सीडी 20 चिकित्सीय एमएबी सीडीसी फ्लो साइटोमेट्री दादी कोशिकाएं
चिकित्सीय एंटीबॉडी के बीच लक्ष्य बाध्यकारी और सीडीसी प्रेरण की तुलना करने के लिए <em>विट्रो</em> विधि में: बायोसमिलाइटी विश्लेषण में अनुप्रयोग
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