Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות
Summary
שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.
Abstract
ישנן שיטות רבות מפותחות לטיהור ולומד חלבונים ופפטידים יחידים. עם זאת, רוב הפונקציות הסלולר מבוצעות על ידי רשתות של קומפלקסי חלבוני אינטראקציה, אשר לעתים קשה לחקור, כי הכבילה אינה ניתן קוולנטיים ומודאג בקלות על ידי טכניקות טיהור. עבודה זו מתארת שיטה של ייצוב ומפריד קומפלקסים חלבונים ילידי מרקמות ללא שינוי באמצעות ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו מימדי. lysate רקמות נטען על ג'ל polyacrylamide כחול שאינם ילידי-denaturing, אז זרם חשמלי מוחל עד חלבון נודד מרחק קצר לתוך הג'ל. רצועת ג'ל המכיל חלבון שמועבר הוא נכרת אז וטופחו עם אמין-reactive-הצלב המקשר dithiobis ריאגנט (propionate succinimidyl), אשר קוולנטית מייצב קומפלקסים חלבונים. רצועת ג'ל המכיל מתחמי צולבים אז הוא יצוק לתוך ג'ל polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן, ו tהוא מורכב הם מופרדים לחלוטין. השיטה נשענת על טכניקות וחומרים המוכרים לרוב הביולוגים המולקולריים, כלומר היא זולה וקלה ללמוד. אמנם היא מוגבלת ביכולת שלה להפריד בין מכלולים גדולים מאוד, ולא הצליחה באופן אוניברסלי, אבל השיטה היתה מסוגלת ללכוד מגוון רחב של קומפלקסים שנלמדו היטב, וישימה ככל הנראה למערכות רבות של עניין.
Introduction
פונקציה סלולרית רגילה תלויה אינטראקציות חלבון-חלבון 1, 2. כתוצאה מכך, מחל אנושיות מסומנות לעתים קרובות על ידי הפרעות באסיפה וההתנהגות של קומפלקסי חלבונים שונים 3. היכולת לאפיין אינטראקציות כזה ולכן הוא קריטי. נוכחי אמצעי לגילוי אינטראקציות אלה דורשים טיהור של חלבונים היעד, לעתים קרובות ואחריו הנפתח של השותפים באינטראקציה שלהם. טיהור קונבנציונלית מושג על ידי צנטריפוגה הפרש, משקעים, ו / או כרומטוגרפיה 4. שיטות אלה הן זמן רב, יש לשנותו לכל חלבון מטרה, ולעתים קרובות לגרום תשואות נמוכות. שיטות לטיהור מודרניות לערב את ההיתוך של תגי פפטיד למקד חלבונים, ואחריו immunoprecipitation או חילוץ על עמודות עמוסות חרוזים מאוגדים מולקולה לכידה 5,"> 6. אמנם זה להרחבה לחלבונים רבים, זה דורש שינוי רצף של היעד, וכתוצאה מכך לגרום מבנים שונים בזיקת השותפים המחייבים הרגיל שלהם. האופי העדין של כמה אינטראקציות חלבון-חלבון אומר ששיטה זו לא יכולה להיות רלוונטית לתרחישים רבים. בנוסף, מבחני הנפתח משמשים למיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא יכולים ללכוד תמונת הסלולר מדויקת, בשל מעלות מוגבלות של חופש ורמות שאינם ילידים של חלבון הפיתיון.
באופן אידיאלי, מתחמי החלבון ניתן היה לזהות מדינות האם שלהם, ללא צורך טיהור או הנפתח. ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי כחול (BN-עמוד) פותחה כחלופה פחות-denaturing כדי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE), ומאפשר הפרדה של כמה חלבונים מתחמי מ דגימות ביולוגיות 7. עם זאת, חלבונים ב-עמוד BN להפריד מבוסס על לארGE מספר משתנים, כולל גודל, מטען, תלת ממדי המבנה, והקשר עם מולקולות אחרות. האינטראקציות של הגורמים הללו לעתים לגרום שיתוף הפרדת חלבונים, היווצרות המצרפי, ורזולוצית להקת חלבון ירודה. דו ממדי ילידים-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה פותרת חלק, אך לא כולם, של בעיות אלו 8.
כדי לעקוף את הסיבוכים הקשורים הפרדה מקומית, חלק מחברים להשתמש ריאגנטים אמינים-reactive cross-linking, כגון dithiobis (propionate succinimidyl) (DSP), כדי ללכוד קומפלקסי חלבוני lysates רקמות 4. lysates מטופלים אלה לאחר מכן ניתן מפוגל מופרד SDS-PAGE, תוך שמירה על הגודל ואיפור יליד מתחמי חלבון. עם זאת, מאז ריאגנטים cross-linking מגיב מבוססים על קרבה של מולקולה אחת לאחרת, וחלבונים ב lysates רקמות יש דרגות חופש רבות ויכולים stochastically אינטראקציה, צלב רקע ספציפי-linking יכול להיות גבוה, במיוחד דגימות מרוכזות. זה יכול להוביל לתוצאות קשות לפרש.
הנה, אנחנו מדגימים את השימוש בשיטה היברידית BN-עמוד / SDS-PAGE, כינה ג'ל אלקטרופורזה multimer-polyacrylamide (multimer-עמוד), להפריד ולהבחין מכלולים החלבון תערובות מורכבות. בתחילה, lysate התא מושעה ב ג'ל polyacrylamide באמצעות BN-עמוד. הג'ל המכילים lysate אז הוא הגיב עם DSP ריאגנט cross-linking. Pseudo-משותק ואינו מופרד מעט על ג'ל, חלבונים הם הרבה פחות סביר להגיב nonspecifically, כלומר תגובתיות רקע צולב מקשר מצטמצמות. לאחר cross-linking, להקות ג'ל הם נכרתו ומופרדים באמצעות SDS-PAGE. הג'ל כתוצאה מכן ניתן לנתח בכל אמצעי הקשורות בדרך כלל ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide. שיטה זו מאפשרת הפרדה וזיהוי של קומפלקסים חלבונים ילידים lysate רקמות ללא שינוי, ללא צורך טיהור נוסף או למשוך-דאוn.
Protocol
Representative Results
Discussion
אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות עבור כל משימת חי דברים לפועל. מסיבה זו, הם מושא לביקורת ומחקר אינטנסיבי. Multimer-עמוד הוא שיטה חדשנית עבור לכידה, מפריד, וניתוח מגוון רחב של קומפלקסי חלבונים. הוכחנו ישימותה בעבר לומד oligimerization של 11-synuclein α חלבון הקשורים למחלות. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
בתמיכת DA034783 NIH / NIDA. אנו מודים בריאן א קילינגר לקבלת סיוע טכני עם-עמוד multimer.
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. . Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
