Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

Normale zelluläre Funktion ist abhängig von Protein-Protein – Wechselwirkungen ^{1, 2.} Als Ergebnis werden menschliche Krankheiten , die oft durch Störungen in der Montage und Verhalten verschiedenen Proteinkomplexe ³ markiert. Die Fähigkeit, solche Interaktionen zu charakterisieren, ist daher von entscheidender Bedeutung. Aktuelle Mittel, um diese Wechselwirkungen zur Detektion erfordern Reinigung von Zielproteinen, die oft durch Pull-Down ihrer Interaktionspartner gefolgt. Herkömmliche Reinigung wird durch differentielle Zentrifugation, Präzipitation durchgeführt, und / oder Chromatographie ^4. Diese Verfahren sind zeitaufwendig, muss für jedes Zielprotein verändert werden, und führen oft zu geringen Ausbeuten. Moderne Reinigungsverfahren umfassen die Fusion von Peptid – Tags an Zielproteine, durch Immunpräzipitation oder Extraktion auf Säulen , gefolgt mit Perlen zu einem Einfang – Moleküle gebunden ⁵ geladen wird ^,„> 6. Während dieses erweiterbaren viele Proteine ist, erfordert es Sequenzmodifikation des Ziels, möglicherweise in Konstrukten führt , die für ihre üblichen Bindungspartner in der Affinität unterscheiden. Die empfindliche Natur einiger Protein-Protein – Wechselwirkungen , bedeutet dieses Verfahren nicht anwendbar sein kann viele Szenarien. Außerdem ist das Pull-down-Assays verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen abbilden kann keine genaue zelluläre Bild erfassen, aufgrund eingeschränkter Freiheitsgrade und nicht-nativen Mengen des Köders Proteins.

Idealerweise Proteinkomplexe könnten zur Reinigung oder Pull-Down ohne die Notwendigkeit, in ihren Heimatstaat nachgewiesen werden. Blau nativen Polyacrylamid – Gelelektrophorese (BN-PAGE) wurde als weniger denaturierende Alternative zu Natriumdodecylsulfat – Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) entwickelt und erlaubt die Trennung von einigen Proteinen und Komplexen aus biologischen Proben ^7. Eine getrennte Proteine ​​in BN-PAGE auf Basis eines LARge Anzahl von Variablen, einschließlich der Größe, Ladung, dreidimensionale Struktur, und die Assoziation mit anderen Molekülen. Die Wechselwirkungen dieser Faktoren führen häufig in Zusammenarbeit Trennung von Proteinen, die Aggregatbildung und schlechter Proteinbande Auflösung. Zweidimensionale nativer Polyacrylamid – Gelelektrophorese löst einige, aber nicht alle dieser Probleme ^8.

Um die Komplikationen zu umgehen mit nativer Trennung verbunden sind , verwenden einige Autoren aminreaktive Vernetzungsreagenzien, wie Dithiobis (succinimidylpropionat) (DSP), Proteinkomplexe in Gewebelysaten ⁴ zu erfassen. Diese behandelten Lysate können dann durch SDS-PAGE denaturiert und abgetrennt werden, während die native Größe und Zusammensetzung von Proteinkomplexen zu erhalten. Da jedoch die Vernetzungsreagenzien auf die Nähe von einem Molekül zum anderen auf Basis reagieren und Proteine ​​in Gewebe-Lysaten haben viele Freiheitsgrade und kann stochastisch interagieren, nicht-spezifischen Hintergrund Quer-Verknüpfung kann in konzentrierten Proben hoch, vor allem sein. Dies kann schwierig zu interpretierenden Ergebnissen führen zu.

Hier stellen wir die Verwendung eines Hybrid-BN-PAGE / SDS-PAGE-Verfahren zeigen, bezeichnet als Multimer-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Multimer-PAGE), zu trennen, und das Protein Baugruppen in komplexen Mischungen zu erfassen. Anfänglich wird Zelllysat in Polyacrylamidgel über BN-PAGE suspendiert. Das Lysat enthaltende Gel wird dann mit dem Vernetzungsreagenz DSP. Pseudo-immobilisierte und leicht auf dem Gel aufgetrennt, Proteine ​​sind viel weniger wahrscheinlich unspezifisch zu reagieren, was bedeutet, Hintergrund Vernetzers Reaktivität verringert wird. Nach der Vernetzung werden die Gel-Banden ausgeschnitten und mittels SDS-PAGE getrennt. Das resultierende Gel kann dann durch ein beliebiges Mittel typischerweise mit Polyacrylamidgelelektrophorese assoziiert analysiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Trennung und den Nachweis von nativen Proteinkomplexen in unmodifizierter Gewebelysat, ohne die Notwendigkeit für eine zusätzliche Reinigung oder Pull-Down.