Summary

Grand Dauphin (Tursiops truncatus) spermatozoïdes : Collection, cryoconservation et la fécondation In Vitro hétérologue

Published: August 21, 2017
doi:

Summary

Nous présentons ici les protocoles qui ont été utilisées avec succès pour la collection de spermatozoïdes de Dauphin, cryoconservation et les performances FIV hétérologue ovocytes bovines.

Abstract

L’utilisation de spermatozoïdes cryoconservés Dauphin facilite l’échange de matériel génétique entre les parcs aquatiques et rend les spermatozoïdes accessible aux laboratoires d’études afin d’améliorer nos connaissances de la reproduction des mammifères marins. FIV hétérologue, un remplacement pour une FIV homologue, pourrait fournir un moyen de tester la fertilité du sperme potentielle ; pour étudier la physiologie des gamètes et début du développement embryonnaire ; et d’éviter l’utilisation d’ovocytes Dauphin précieux, qui sont difficiles à obtenir. Nous présentons ici les protocoles qui ont été utilisées avec succès pour recueillir et cryopréserver des spermatozoïdes de Dauphin. La collecte de sperme s’effectue par stimulation manuelle des dauphins formés. Cryoconservation s’effectue à l’aide d’un extenseur de jaune d’oeuf-basée de TRIS avec le glycérol. En outre, nous présentons un protocole décrivant les FIV hétérologue utilisant Dauphin spermatozoïdes et les ovocytes bovines et qui vérifie la nature hybride de l’embryon qui en résulte, à l’aide de la PCR. La fécondation hétérologue soulève des questions sur la fécondation et peut servir comme un outil pour étudier la physiologie des gamètes et début du développement embryonnaire. En outre, le succès de la FIV hétérologue démontre le potentiel de cette technique pour tester le sperme Dauphin fertilisation de capacité, qui mérite un examen plus poussé.

Introduction

Techniques de procréation assistée sont peu développés chez les animaux sauvages, y compris les mammifères marins. L’absence de méthodes sensibles pour évaluer la réussite fécondante du sperme contribue au développement lent des technologies de la reproduction chez les espèces comme les dauphins. Il n’était pas jusqu’à une date récente que les paramètres fondamentaux séminales du grand dauphin (Tursiops truncatus) ont été signalés1,2. Toutefois, des variables telles que la motilité et la morphologie, bien que largement utilisé, donnent des informations limitées sur l’efficacité reproductive. Le meilleur indicateur de la qualité du sperme est l’évaluation du potentiel fécondatrice des cultures.

Récemment, notre groupe a utilisé une méthode pour évaluer les spermatozoïdes Dauphin potentiel de la fertilisation en évaluant la formation pronucléaire mâle et/ou formation d’embryon hybride après FIV hétérologue utilisant zona intact ovocytes bovine3. L’utilisation de la FIV hétérologue Dauphin-bovin a des avantages importants par rapport aux homologues FIV, car il permet de surmonter la difficulté d’obtenir des ovocytes de Dauphin et facilite l’utilisation de bien testé in vitro bovine oocyte maturation des systèmes. Afin d’éviter la spécificité d’espèce, la fécondation hétérologue est généralement réalisée en l’absence de ZP. Même si elle permet l’évaluation de la capacité des spermatozoïdes acrosome-réagi à fusionner avec la membrane vitelline, elle porte atteinte à l’évaluation d’autres fonctionnalités liées à la fertilisation. La procédure décrite utilise zona ovocytes intacts et permet l’évaluation des paramètres suivants : liaison de zona de sperme et attachement, pénétration, polyspermie, formation pronucléaire et clivage embryon hybride.

Nous présentons ici plusieurs protocoles de prélèvement du sperme, base spermogramme, congélation de spermatozoïdes ainsi que l’évaluation de la fonctionnalité de sperme Dauphin en évaluant mâle pronucléaire et/ou hybrides formation des embryons après FIV hétérologue utilisant zona intact ovocytes bovines.

Protocol

déclaration d’éthique : toutes les procédures expérimentales ont été examinés et approuvés par le Comité de l’utilisation de l’Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) et d’institutionnels animalier. Toutes les expériences ont été effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, tel qu’adopté par la société pour l’étude de la Reproduction et à la Loi sur le bien-être Animal pour les soins des mammifères m…

Representative Results

Toutes les résultats, les tables et les figures (1 et 2) présentées ici ont été reproduites avec la permission de3. Les spermatozoïdes des dauphins ont grande motilité après congélation-décongélation Les éjaculats congelé-décongelé Dauphin a montré les pourcentages (% ± SD) 84.5 ± 5,3 total motile et 69,1 ± 5.1 progressive sperma…

Discussion

Pour de nombreuses espèces de mammifères différents, il y a divers avantages à l’utilisation de sperme congelé-décongelé. Celles-ci comprennent la possibilité de transférer le matériel génétique précieux, le potentiel de distribution dans le monde entier, le faible risque de contamination et la capacité de préserver des gamètes mâles pendant des décennies. L’utilisation de spermatozoïdes cryoconservés est essentielle pour le grand dauphin, parce que cette espèce est protégée en vertu de l’ann…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ses travaux ont été financés par le ministère espagnol de l’économie et la compétitivité (AGL2015-70140-R à D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan et J. F. Pérez-Gutiérrez et Seneca Fondation de Murcie (Grant 20040/germe/16 à F. García-Vázquez)

Materials

FERT-TALP medium Merck
TCM-199 Sigma M-4530
Hoechst 33342 Sigma B-2261
4-well dishes Nunc 176740
Density gradient BoviPure Nidacon International BP-100
Washing solution Boviwash Nidacon International BW-100
Magnesium chloride Promega A35 1H
Sterile water Mili Q sintesis A10 Millipore A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA Sigma T4415
MB agarose Biotools 20.012
5X GoTaq flexi buffer Mili Q sintesis A10 Millipore M 890 A
MB agarose Biotools 20.012
Taq polymerase Promega
SafeView NBS Biologicals Ltd. M 890 A
Makler counting chamber Sefi Medical
Thoma chamber Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000 Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300 Norwood
Computer assisted sperm analysis system Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95 Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300 Nikon
Confocal assistant 4.02 software Bio-Rad 3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) Gilson
Microcentrifuge tubes VWR
UV iluminator Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus MWG AG Biotech

References

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Sánchez-Calabuig, M. J., García-Vázquez, F. A., Laguna-Barraza, R., Barros-García, C., García-Parraga, D., Rizos, D., Gutiérrez Adan, A., Pérez-Gutíerrez, J. F. Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (126), e55237, doi:10.3791/55237 (2017).

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