Summary

دلافين الدلفين (Tursiops truncatus) المني: جمع، ونعد، والإخصاب في الأنابيب مغايرة

Published: August 21, 2017
doi:

Summary

نقدم هنا، البروتوكولات التي استخدمت بنجاح لجمع المني الدلفين ونعد مغايرة أداء التلقيح الاصطناعي باستخدام بويضات الأبقار.

Abstract

استخدام المني دولفين cryopreserved يسهل تبادل المواد الجينية بين الحدائق المائية ويجعل المني الوصول إلى مختبرات للدراسات زيادة فهمنا لاستنساخ الثدييات البحرية. مغايرة التلقيح الاصطناعي، بديلاً للتلقيح الاصطناعي مثلى، يمكن أن توفر وسيلة لاختبار خصوبة الحيوانات المنوية المحتملة؛ لدراسة علم وظائف الأعضاء مشيج والتنمية الجنين في وقت مبكر؛ وتجنب استخدام بويضات دولفين القيمة، التي يصعب الحصول عليها. نقدم هنا، البروتوكولات التي استخدمت بنجاح لجمع وكريوبريسيرفي المني الدلفين. يتم جمع السائل المنوي بالتحفيز اليدوي على الدلافين المدربة. يتم إنجاز تجميد استخدام تريس صفار بيض على أساس موسع مع الجلسرين. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم من بروتوكول التي تصف مغايرة التلقيح الاصطناعي باستخدام المني الدلفين وبويضات الأبقار وأن يتحقق من طبيعة هجينة من الأجنة الناتجة باستخدام PCR. يثير تساؤلات حول التسميد التسميد مغايرة ويمكن استخدامها كأداة لدراسة فسيولوجيا مشيج والتنمية الجنين في وقت مبكر. وبالإضافة إلى ذلك، يوضح نجاح التلقيح الاصطناعي مغايرة إمكانات هذا الأسلوب لاختبار دولفين الحيوانات المنوية إخصاب القدرة، التي تستحق مزيدا من الدراسة.

Introduction

تقنيات مساعدة الإنجاب هي متطورة في الحيوانات البرية، بما في ذلك الثدييات البحرية. عدم وجود أساليب حساسة لتقييم نجاح صنع الأسمدة الحيوانات المنوية يساهم في بطء تطور تقنيات الإنجاب في الأنواع مثل الدلفين. لم يكن حتى وقت قريب أن البارامترات الأساسية المنوي من قاروري (Tursiops truncatus) تم الإبلاغ عن1،2. ومع ذلك، متغيرات مثل حركية ومورفولوجيا، على الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع، تعطي معلومات محدودة عن الكفاءة التناسلية. أفضل مؤشر لنوعية الحيوانات المنوية هو تقييم إمكانية صنع الأسمدة.

في الآونة الأخيرة، استخدمت مجموعتنا طريقة لتقييم دولفين الحيوانات المنوية إخصاب المحتملة بتقييم تكوين pronuclear الذكور و/أو تشكيل الجنين المختلطة بعد التلقيح الاصطناعي مغايرة استخدام زونا بويضات الأبقار سليمة3. مزايا هامة أكثر من التلقيح الاصطناعي مثلى، كما أنها تتغلب على صعوبة الحصول على بويضات دولفين استخدام البقر دولفين مغايرة التلقيح الاصطناعي ويسهل استخدام المجربة في المختبر البويضيه البقري نضوج نظم. تفاديا لخصوصية الأنواع، يتم التسميد مغايرة عموما في غياب ZP. على الرغم من أنه يسمح لتقييم قدرة المني acrosome-ورد أن تلتحم مع الغشاء فيتيلين، أنه يعوق تقييم الميزات الأخرى المتصلة بالتخصيب. الإجراء المذكور يستخدم زونا بويضات سليمة ويسمح بتقييم المعلمات التالية: الحيوانات المنوية زونا والملزمة ومرفق، الاختراق، بوليسبيرمي، وتشكيل برونوكليار، الانقسام هجين والجنين.

هنا، نحن نقدم عدة بروتوكولات لجمع الحيوانات المنوية وتحليل الحيوانات المنوية الأساسية، وتجميد المني، فضلا عن تقييم وظائف الحيوانات المنوية دولفين بتقييم الذكور برونوكلير و/أو الهجين تكوين الجنين بعد التلقيح الاصطناعي مغايرة استخدام زونا سليمة بويضات الأبقار.

Protocol

بيان الأخلاق: جميع الإجراءات التجريبية التي تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة ذ المعهد الوطني لبحوث التكنولوجيا الزراعي y اليمنتيريا (المعهد). جميع التجارب التي أجريت وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، كما اعتمدها المجتمع “دراسة الاستن?…

Representative Results

جميع النتائج والجداول والأرقام (1 و 2) المقدمة هنا قد تم نسخها مع إذن3. وقد المني دولفين حركية عالية بعد التجميد والذوبان وأظهرت الدفقات دولفين إذابة تجميد النسب المئوية (% ± SD) من مجموع 84.5 ± 5.3 متح?…

Discussion

للعديد من أنواع الثدييات المختلفة، هناك مزايا متنوعة لاستخدام الحيوانات المنوية المجمدة-مذاب. وتشمل هذه القدرة على نقل المواد الجينية قيمة وإمكانات لتوزيعها في جميع أنحاء العالم وانخفاض خطر التلوث والقدرة على الحفاظ على الأمشاج الذكور على مدى عقود. استخدام الحيوانات المنوية cryopreserved ضرو…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد مولت عمله الإسبانية وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية (AGL2015-70140-R إلى ريزوس د)، AGL2015-66145R أن جوتيريز-عدن أ وج. ف. بيريز-غوتييريز ومؤسسة مورسيا سينيكا (20040 المنح/الجرثومية/16 إلى ف. غارسيا-فاسكيز)

Materials

FERT-TALP medium Merck
TCM-199 Sigma M-4530
Hoechst 33342 Sigma B-2261
4-well dishes Nunc 176740
Density gradient BoviPure Nidacon International BP-100
Washing solution Boviwash Nidacon International BW-100
Magnesium chloride Promega A35 1H
Sterile water Mili Q sintesis A10 Millipore A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA Sigma T4415
MB agarose Biotools 20.012
5X GoTaq flexi buffer Mili Q sintesis A10 Millipore M 890 A
MB agarose Biotools 20.012
Taq polymerase Promega
SafeView NBS Biologicals Ltd. M 890 A
Makler counting chamber Sefi Medical
Thoma chamber Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000 Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300 Norwood
Computer assisted sperm analysis system Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95 Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300 Nikon
Confocal assistant 4.02 software Bio-Rad 3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) Gilson
Microcentrifuge tubes VWR
UV iluminator Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus MWG AG Biotech

References

  1. Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
  2. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
  3. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
  4. Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
  5. Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
  6. Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
  7. Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
  8. Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
  9. Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
  10. Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
  11. Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
  12. Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
  13. Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).

Play Video

Cite This Article
Sánchez-Calabuig, M. J., García-Vázquez, F. A., Laguna-Barraza, R., Barros-García, C., García-Parraga, D., Rizos, D., Gutiérrez Adan, A., Pérez-Gutíerrez, J. F. Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (126), e55237, doi:10.3791/55237 (2017).

View Video