כאן, אנו מתארים שיטה לטעינת צבע סידן רגיש דרך גדם העצב הצפרדע לתוך קצות העצבים. כמו כן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת וניתוח של טרמינטים סידן מהיר בקצות העצבים ההיקפיים.
אחת השיטות האפשריות ביותר למדידת רמות סידן presynaptic מסופי עצב presynaptic הוא הקלטה אופטי. הוא מבוסס על שימוש בסידן צבעי ניאון רגישים שמשנים את עוצמת הפליטה שלהם או את אורך הגל בהתאם לריכוז הסידן החופשי בתא. ישנן מספר שיטות המשמשות כתם תאים עם צבע סידן. הנפוצים ביותר הם תהליכים של טעינת צבעים באמצעות micropipette או מראש incubating עם צורות acetoxymethyl אסתר של צבעים. עם זאת, שיטות אלה אינם ישימים לחלוטין צמתים neuromuscular (NMJs) בשל בעיות מתודולוגיות המתעוררות. במאמר זה, אנו מציגים שיטה להעמסת צבע סידן רגיש דרך גדם העצב הצפרדע של עצב הצפרדע לתוך קצות העצבים. מאז הכניסה של סידן חיצוני לתוך מסופי העצבים ואת המחייב הבאים לצבוע סידן להתרחש בתוך זמן מיליקונד בקנה מידה, יש צורך להשתמש במערכת הדמיה מהירה לרשום אלה אינטראקטיביותNs. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להקלטת סידן חולפת עם מצלמת CCD מהירה.
סידן יונים (Ca 2 + ) להשתתף בתהליכי איתות עצביים רבים, כולל ייזום, תחזוקה, ופלסטיות של שחרור המתווך 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . עם הגעתו של פוטנציאל הפעולה, תאיים Ca 2 + נכנס מסוף העצבים ויזם שחרור נוירוטרנסמיטר. בסינפסות מסוימות, זרם הסידן ניתן למדוד ישירות בשיטות אלקטרופיזיולוגיות 6 , 7 , 8 . במקרה של צומת neuromuscular (NMJ), לא ניתן להשתמש מהדק תיקון ישיר שתי אלקטרודות מתח טכניקות מלחציים בשל גודל הדקות של קצות העצבים.
הקלטות של פנים Ca 2 + זרמים מן קצות העצבים של NMJ יכול להיעשות על ידי electrophys עקיפהשיטות יולוגיות 9 , 10 . עם זאת, שיטות אלה דורשות טיפול מוקדם של סינפסה על ידי נתרן אשלגן יון חוסמי ערוץ. שיטות אופטיות אינן דורשות הפרדה פרמקולוגית של יונים זרמים במסוף העצבים ולאפשר הקלטות של Ca 2 + זרם, מופעלות על ידי פוטנציאל פעולה, ואת העלאה הבאים של יונים Ca 2 + ב axoplasm 11 , 12 , 13 , 14 . שיטות אלה מבוססים על הקלטות של שינויים הקרינה של Ca ספציפי 2 + צבעים רגישים על הכריכה של חינם Ca 2 + יונים 15 , 16 , 17 , 18 , 19 .
Ca 2 + מחוונים ניתן לטעון לתוך cElls באמצעות מגוון של שיטות, בהתאם למטרה של הניסוי. החוקרים להשתמש ביישום אמבטיה של צורות לצבוע חדיר קרום 20 , 21 , טוען דרך פיפטה תיקון 22 , או microinjection 23 , 24 , 25 . עם זאת, כל השיטות הללו יש מגבלות מסוימות במקרה של NMJ בשל הייחודיות שלה ארכיטקטורה סינפטי. עבור NMJ, השיטה הנוחה והמצליחה ביותר היא לטעון את הצבע דרך גדם העצב, שיטת מילוי קדימה 26 , 27 , 28 , 29 . טכניקה זו יכולה לשמש לטעינת צבעים שונים הקרינה לתוך קצות העצבים ההיקפיים. שיטה זו שימשה בהצלחה עבור מסופי עצב תסיסנית 28 , עצב המנוע לטאה28 , ו צפרדע מוטורי מסופי העצבים 17 , 26 , 27 , 30 . בהתאם לאובייקט הנחקר, פרטים שיטתיים עשויים להשתנות. זכוכית מיקרו פיפטה ניתן להשתמש עבור עצבים קטנים מן הזחלים 28 . כמה חוקרים תיארו שיטה 27 , 28 שבה סוף לחתוך טרי של עצב innervating שריר שקוע לתוך היטב מראש מלא צבע. ההכנה נשארת לכמה שעות כדי לספוג את הצבע. הצבע נספג על ידי האקסונים ומועבר אל מסופי העצבים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה של טעינת אינדיקטור פלואורסצנטי לתוך צפרדעים עצב מוטורי המנוע דרך גזע עצב. הפרוטוקול שלנו משתמש קצה פיפטה פלסטיק עבור הדגירה של הרקמה עם צבע. כמו כן, אנו מתארים כיצד לרכוש ולנתח Ca 2 + פלואורסצנטי traמטופלים.
במאמר זה, הצגנו את השיטה של ביצוע Ca 2 + רגיש טעינת צבע לתוך קצות העצבים צפרדע דרך גדם עצב. בסוף הליך הטעינה, כל המסופים בחלק הפרוקסימלי של העצב יש רמות משמעותיות של הקרינה. ההערכה היא כי הריכוז בתוך המסוף של החללית נע בין 40 ל 150 מיקרומטר 17 .
הליך הדגירה מתבצע בשני שלבים: בטמפרטורת החדר ולאחר מכן בטמפרטורה נמוכה יותר במקרר. חשוב לשלוט על זמן הדגירה רקמה עם צבע בטמפרטורת החדר. בהתאם אורך בפועל של גדם עצב, צבע ספציפי, ואת הטמפרטורה, זמן הדגירה עשוי להשתנות. אם overexposed, מסופים בחלקים הפרוקסימלי קרוב לגדם עצב ניתן לעומס יתר על המידה. עם זאת, בחלק האמצעי של העצב, עדיין ניתן למצוא מסופים כי הם טעונים בצורה משביעת רצון. במהלך הE הדגירה ארוכה במקרר, צבע מופץ באופן שווה מעל קצות העצבים.
התצפיות שלנו 33 , 35 , כמו גם את הנתונים של חוקרים אחרים 30 , להוכיח את חוסר כל השפעה ניכרת של הליך הטעינה על משרעת התגובה postsynaptic או על תדירות של פוטנציאל צלחת מיניאטורה. אריכות ימים טובה תועדה בהכנות הטעונות. יש כמה נקודות חשובות ברצוננו למשוך תשומת לב. זה מאוד חיוני כדי למקם את גדם העצב לתוך פתרון טעינת צבע בתוך דקות ספורות לאחר כריתה כדי לאפשר לצבוע להיכנס לתוך האקסונים של עצב לחתוך; עיכובים יכולים לגרום לטעינה לא יעילה, ככל הנראה בשל resealing של אקסונים העצבים 27 , 36 . כמה חוקרים לטבול את גדם העצב ב 100 מ"מ EDTA (a Ca 2 + – ו Mg 2 + -chelator) מיד לאחר כריתה של העצב כדי למנוע את האקסונים לחתוך מ resealing. המאגר מוסר לאחר 1-2 דקות והוחלף עם פתרון טעינה צבע 37 . השימוש של ג 'ל נפט היטב במקום צינורות פלסטיק עבור הליך הטעינה מאפשר שימוש בגדם עצב קצר יותר. תוך שימוש בגישה זו, עצב הוא נחתך לאחר שהוא שקוע הפתרון HEPES עם צבע, ואת האקסונים לא reseal בגלל חוסר יונים divalent בפתרון צבע 27 , 28 .
במחקר שלנו, השתמשנו בצורת מלח מסיס במים של מחוון Ca 2 + במקום dextran. הצמד דקסטרן מפוזר באקסון לאט יותר מאשר צורות מלח. עם זאת, השימוש מצומד dextran מפחית compartmentalization צבע וטיפול על ידי עצב NMJs. סידן ירוק 1-3,000 MW dextran מצומד יש קצב דיפוזיה טוב מדגים ממודרים מופחת <s Up class = "xref"> 38.
חשוב מאוד למנוע תקופה ארוכה של תאורה פלואורסצנטי של הרקמה, כי זה משפיע על בריאותו והישרדותו. אנו משתמשים באופטי נומרסקי בערוץ האור הנראה כדי לחפש מסופי עצבים. במהלך ההקלטה, אנו מגבילים את השדה המואר באמצעות דיאפרגמה.
ראוי לציין כי שיטת הטעינה הזו מתאימה רק להכנות שעשויות לעמוד בדגירות ארוכות. כדי להקטין את זמן הטעינה כאשר מחקרים נערכים על רקמות שבריריות יותר ( למשל, סינפסות של בעלי חיים חם דם), יש צורך downscale את אורך עצב העצבים להשתמש micropipettes לטעינת 29 , 39 .
טכניקת הטעינה הזו מתאימה היטב לשינויים הדמיה cytosolic Ca 2 + , עם אינדיקטורים ניאון תחת שני גירוי עצב יחיד ופעילות סינפטי קצביEf "> 17 , 27 , 35. ניתוח של משרעת Ca 2 + -Transient ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעה של חומרים שונים על כניסת סידן המשתתף שחרור נוירוטרנסמיטר 33 .
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה בוצע במסגרת תוכנית הממשלה הרוסית לצמיחה תחרותית של אוניברסיטת קאזאן הפדרלית ומענק מהקרן הרוסית למחקר בסיסי (16-04-01051, 16-34-00817, 15-04-02983). אנו מודים ארבעה בודקים אנונימיים על מתן הערות מועילות על טיוטות קודמות של כתב היד. אנו מביעים את הכרת התודה שלנו ל- Yuliya Aratskaya על ההקלטה הקולית. אנו מודים לד"ר ויקטור אילין על הערות מועילות רבות ועזרה עם עריכת finale של כתב היד.
Ca2+ indicator | Molecular Probes, USA | Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 | 500 μg |
Silicone Elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 elastomer | |
Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10µL |
Pipette tip | Fisher Scientific, USA | 02-707-175 | 10µL |
Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10µL |
Razor Blade | Fisher Scientific, USA | 12-640 | |
Minutien Pins | Fine scince tools, Canada | 26002-20 | |
Corneal Mini-Scissors | MT MEDI CORP, Canada | S-1111 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9610 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9611 | |
Modelling clay | local producer | can be replaced by any local producer | |
Petroleum jelly | local producer | can be replaced by any local producer | |
Microspin FV 2400 | Biosan, Latva | BS-010201-AAA | |
Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latva | BS-010205-AAN | |
Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40mm |
Syrynge | local producer | 0.5 ml | |
HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100ml |
Microscope, BX51 | Olympus, Japan | ||
Stereomicroscope, Leica М80 | Leica Microsystems , Germany | ||
Illumination system Leica CLS 150Х | Leica Microsystems, Germany | ||
Data acquisition system | Molecular Devices, USA | Digitdata 1550 | |
software | Molecular Devices, USA | pClamp software, Version 10 | protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro |
Bath and bath temperature controler | Experimental Builder | can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ | |
Monochromator | Till Photonics, Germany | Polychrome V | no longer available, can be replaced by other sutable stable light source 488 nm |
monochromator control software | Till Photonics, Germany | Polycon | |
Digital CCD camera | Redshirt imaging, USA | Neuro CCD SMQ | |
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems, USA | ||
Suction electrode | Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob’ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. - 2015. – T. 40. – №9. – S. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii- biologicheskix-obektov/ |
|
Acquisition software for CCD camera | Redshirt imaging, USA | Turbo SM software | |
ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel |