Hier beschrijven we een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de kikker zenuwstomp in de zenuwuitgangen. We presenteren ook een protocol voor de opname en analyse van snelle calcium transiënten in de perifere zenuw eind.
Een van de meest haalbare methoden voor het meten van presynaptische calciumniveaus in presynaptische zenuwterminals is optische opname. Het is gebaseerd op het gebruik van calciumgevoelige fluorescerende kleurstoffen die hun emissieintensiteit of golflengte veranderen afhankelijk van de concentratie van vrij calcium in de cel. Er zijn verschillende methoden gebruikt om cellen met calciumkleurstoffen te vlek. Meest voorkomend zijn de processen om de kleurstoffen te laden door middel van een micropipet of pre-incubatie met de acetoxymethylestervormen van de kleurstoffen. Deze methoden zijn echter niet goed van toepassing op neuromusculaire kruispunten (NMJ's) als gevolg van methodologische problemen die zich voordoen. In dit artikel presenteren we een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de kikker zenuwstomp van de kikkernauw in de zenuwuitgangen. Aangezien de invoer van extern calcium in zenuwterminals en de daaropvolgende binding aan de calciumverf binnen de milliseconde tijdschaal plaatsvinden, is het nodig om een snel beeldvormingssysteem te gebruiken om deze interactie te registrerenNS. Hier beschrijven we een protocol voor het opnemen van het calcium transient met een snelle CCD camera.
Calciumionen (Ca 2+ ) nemen deel aan veel neuronale signaleringsprocessen, inclusief de initiëring, onderhoud en plasticiteit van mediator release 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Bij de komst van het actiepotentiaal komt extracellulaire Ca 2+ in de zenuwterminal en begint de vrijgave van neurotransmitter. In sommige synapses kan de calciumstroom direct met behulp van elektrofysiologische methoden 6 , 7 , 8 worden gemeten. In het geval van de neuromusculaire verbinding (NMJ) kan men geen directe patch klemmen en twee-elektrode spanningsklemtechnieken gebruiken door de minutengrootte van de zenuwuitgangen.
Opnamen van inwendige Ca 2+ stromen van de zenuwuitgangen in de NMJ kunnen worden gedaan door indirecte elektrofielenIologische methoden 9 , 10 . Deze methoden vereisen echter de voorbehandeling van de synaps door natrium- en kaliumionkanaalblokkers. Optische methoden vereisen geen farmacologische scheiding van ionische stromingen in de zenuwterminal en laten opnamen van Ca 2+ -toevoer toe, veroorzaakt door actiepotenties en de daaropvolgende verhoging van Ca 2+ ionen in de axoplasma 11 , 12 , 13 , 14 . Deze methoden zijn gebaseerd op opnames van veranderingen in de fluorescentie van specifieke Ca 2+ -gevoelige kleurstoffen bij de binding van vrije Ca 2 + ionen 15 , 16 , 17 , 18 , 19 .
Ca 2+ indicatoren kunnen in de c worden geladenElls door een verscheidenheid aan methoden, afhankelijk van het doel van het experiment. Onderzoekers gebruiken de badtoepassing van membraandoorlaatbare kleurstofvormen 20 , 21 , laden via patchpipette 22 of microinjectie 23 , 24 , 25 . Echter, al deze methoden hebben enkele beperkingen in het geval van de NMJ vanwege zijn eigenaardigheden in synaptische architectonica. Voor de NMJ is de meest geschikte en succesvolle methode de kleurstof door de zenuwstomp, een voorvulmethode 26 , 27 , 28 , 29 te laden . Deze techniek kan gebruikt worden voor het laden van verschillende fluorescentie-kleurstoffen in de perifere zenuwuitgangen. Deze methode is succesvol gebruikt voor Drosophila zenuwterminals 28 , de hagedis motorische zenuw28 en kikkermotor zenuwterminals 17 , 26 , 27 , 30 . Afhankelijk van het onderzochte object kunnen methodische details variëren. Een glazen micropipet kan worden gebruikt voor kleine zenuwen van larven 28 . Verscheidene onderzoekers hebben een methode beschreven 27 , 28 waarin een vers gesneden einde van de zenuw die een spier binnentreedt, wordt gedompeld in een put die vooraf met een kleurstof wordt gevuld. De voorbereiding wordt vervolgens enkele uren gelaten om de kleurstof te laten ontdoen. De kleurstof wordt door de axonen doordrenkt en naar de zenuwterminals vervoerd. In dit artikel beschrijven we een methode om een fluorescentie-indicator in te laden in kikkermotor zenuwterminals via de zenuwstomp. Ons protocol maakt gebruik van een plastic pipet tip voor de incubatie van het weefsel met een kleurstof. We beschrijven ook hoe Ca 2+ fluorescentie tra te verwerven en analyserennsients.
In dit document hebben we de methode voor het uitvoeren van Ca 2+ -gevoelige kleurstoflading in de zenuwuitgangen van kikker door de zenuwstomp gepresenteerd. Aan het eind van de laadprocedure hebben alle terminals in het proximale gedeelte van de zenuw significante niveaus van fluorescentie. Er is geschat dat de intra-terminale concentratie van de sonde tussen 40 en 150 μM 17 varieert.
De incubatieprocedure wordt uitgevoerd in twee stappen: bij kamertemperatuur en dan bij een lagere temperatuur in de koelkast. Het is belangrijk om de tijd van weefsel incubatie met de kleurstof bij kamertemperatuur te controleren. Afhankelijk van de werkelijke lengte van de zenuwstomp, de specifieke kleurstof en de temperatuur kan de incubatietijd variëren. Als u overbelicht bent, kunnen terminals in de proximale delen dicht bij de zenuwstomp overbelast worden. In het midden van de zenuw is het echter nog steeds mogelijk om terminals te vinden die bevredigend geladen zijn. Tijdens de thEen lange incubatie in de koelkast, de kleurstof is gelijkmatig verdeeld over de zenuwuitgangen.
Onze eigen waarnemingen 33 , 35 , evenals de gegevens van andere onderzoekers 30 , bewijzen dat er geen significante invloed is op de laadprocedure op de amplitude van de postsynaptische respons of op de frequentie van miniatuur eindplaatpotenties. Goede levensduur werd gedocumenteerd in de geladen voorbereidingen. Er zijn enkele belangrijke punten waaraan we aandacht willen vestigen. Het is essentieel om de zenuwstomp in de kleurstofoplossingsoplossing binnen een paar minuten na de excisie te plaatsen om de kleurstof in de axonen van de gesneden zenuw in te gaan. Vertragingen kunnen ondoeltreffend laden veroorzaken, vermoedelijk door de wederopening van zenuwassons 27 , 36 . Sommige onderzoekers dompelen de zenuwstomp in 100 mM EDTA (een Ca 2+ – en Mg 2+ -chelator) Onmiddellijk na het uitsnijden van de zenuw om te voorkomen dat de gesneden axonen opnieuw worden afgesloten. De buffer wordt na 1-2 minuten verwijderd en vervangen door een kleurstofoplossingsoplossing 37 . Het gebruik van een petroleumgelputje in plaats van plastic buizen voor de laadprocedure maakt het gebruik van een kortere zenuwstomp mogelijk. Tijdens het gebruik van deze aanpak wordt de zenuw gesneden nadat het in de HEPES-oplossing met kleurstof is gedompeld, en de axonen worden niet teruggeteld door het gebrek aan tweewaardige ionen in de kleurstofoplossing 27 , 28 .
In onze studie gebruikte we de in water oplosbare zoutvorm van de Ca 2+ indicator in plaats van dextran. De dextranconjugaten diffunderen langzamer in de axon dan de zoutvormen. Echter, het gebruik van het dextranconjugaat vermindert kleurstofcompartmentalisatie en behandeling door de zenuw en NMJ's. Calcium Groen 1-3000 MW dextran conjugaat heeft een goede diffusie snelheid en demonstreert verminderde compartimentalisatie <s Up class = "xref"> 38.
Het is erg belangrijk om een lang periode van fluorescerende verlichting van het weefsel te vermijden, omdat dit de gezondheid en het overleven beïnvloedt. We gebruiken Nomarski-optica in het zichtbare lichtkanaal om te zoeken naar zenuwterminals. Tijdens de opname beperken we het verlichte veld met behulp van een diafragma.
Het is opmerkelijk dat deze laadmethode alleen geschikt is voor preparaten die lange incubaties kunnen weerstaan. Om de kleurstof te beperken wanneer studies worden uitgevoerd op meer kwetsbare weefsels ( bijv. Synaptes van warmbloedige dieren), is het nodig om de zenuwstomplengte te verkleinen en micropipetten te gebruiken voor het laden van 29 , 39 .
Deze laadtechniek is goed geschikt voor beeldvormende veranderingen in cytosolische Ca 2+ , met fluorescentie-indicatoren onder zowel enkel-zenuwstimulatie als ritmische synaptische activiteitEf "> 17 , 27 , 35. De analyse van de Ca 2+ transient amplitude kan gebruikt worden om de invloed van verschillende stoffen op de calciuminvoer te onderzoeken die deelneemt aan neurotransmitter vrijgave 33 .
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek is uitgevoerd onder het Russische Stichting Program voor Concurrerende Groei van de Kazan Federale Universiteit en een subsidie van de Russische Stichting voor Basisonderzoek (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). We bedanken vier anonieme recensenten voor het geven van nuttige opmerkingen over eerdere ontwerpen van het manuscript. Wij danken Yuliya Aratskaya voor de stemopname. Wij zijn dankbaar voor Dr. Victor Ilyin voor de vele nuttige opmerkingen en de hulp bij de finale bewerking van het manuscript.
Ca2+ indicator | Molecular Probes, USA | Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 | 500 μg |
Silicone Elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 elastomer | |
Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10µL |
Pipette tip | Fisher Scientific, USA | 02-707-175 | 10µL |
Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10µL |
Razor Blade | Fisher Scientific, USA | 12-640 | |
Minutien Pins | Fine scince tools, Canada | 26002-20 | |
Corneal Mini-Scissors | MT MEDI CORP, Canada | S-1111 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9610 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9611 | |
Modelling clay | local producer | can be replaced by any local producer | |
Petroleum jelly | local producer | can be replaced by any local producer | |
Microspin FV 2400 | Biosan, Latva | BS-010201-AAA | |
Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latva | BS-010205-AAN | |
Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40mm |
Syrynge | local producer | 0.5 ml | |
HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100ml |
Microscope, BX51 | Olympus, Japan | ||
Stereomicroscope, Leica М80 | Leica Microsystems , Germany | ||
Illumination system Leica CLS 150Х | Leica Microsystems, Germany | ||
Data acquisition system | Molecular Devices, USA | Digitdata 1550 | |
software | Molecular Devices, USA | pClamp software, Version 10 | protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro |
Bath and bath temperature controler | Experimental Builder | can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ | |
Monochromator | Till Photonics, Germany | Polychrome V | no longer available, can be replaced by other sutable stable light source 488 nm |
monochromator control software | Till Photonics, Germany | Polycon | |
Digital CCD camera | Redshirt imaging, USA | Neuro CCD SMQ | |
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems, USA | ||
Suction electrode | Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob’ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. - 2015. – T. 40. – №9. – S. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii- biologicheskix-obektov/ |
|
Acquisition software for CCD camera | Redshirt imaging, USA | Turbo SM software | |
ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel |