Summary

反応性アストロ サイトと増殖の in Vitro虚血のような条件下での監視

Published: October 21, 2017
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Summary

虚血性脳卒中、酸素無グルコース (OGD) に影響を受ける脳の領域にアストロ サイトの特定の貢献がさらされて複雑なイベントは調査しにくい。孤立したアストロ サイトを取得し、反応性、OGD 条件下での増殖を研究する手法を紹介します。

Abstract

虚血性脳卒中は血栓や塞栓脳の部分への血流を妨害によって引き起こされる複雑な脳損傷です。これは、酸素とブドウ糖のエネルギー不全や神経細胞死を引き起こすの剥奪に します。虚血性脳卒中の侮辱後、アストロ サイトは反応になるし、それが発展するにつれ、損傷部位の周囲増殖します。このシナリオの下では、虚血にさらされている脳の領域にアストロ サイトの特定の貢献を研究することは困難です。したがって、プライマリ アストロ サイトの反応と酸素無グルコース (OGD) と呼ばれる虚血のような環境の生体外モデルの下で増殖を検討する方法を紹介します。アストロ サイトは 1-4 日から分離された-古い新生児ラットと非特異的アストロ サイト細胞の数は、アストロ サイト選択的マーカー グリア線維性酸性蛋白質 (GFAP) と染色性が核を使用して評価されました。公開されている酸素の割合のと同様、OGD 条件に服従するアストロ サイトの期間をカスタマイズできます。この柔軟性により、細胞の試験管内のさまざまなグループの虚血のような条件の期間を特徴付けるための科学者です。この資料では、反応性アストロ サイト、肥大形態と増殖細胞核抗原 (PCNA) を用いた蛍光抗体法によって測定される増殖を誘発する OGD の時間枠について説明します。増殖、ほかアストロ サイトはエネルギーと酸化ストレスを受けるし、細胞培地に可溶性因子を放出し OGD に対応します。このメディアを収集し、分子細胞間相互作用のない初代神経細胞培養アストロ サイトによるリリースの影響を分析するために使用することができます。要約すると、傷害に孤立したアストロ サイトの役割を理解するこの一次電池文化モデルを効率的に使用できます。

Introduction

ストロークは、「、急性神経障害血管由来の症状と脳の焦点区域の関与に対応する徴候の突然または急速な開発と」1,2として定義されます。ストロークの 2 つの種類があります: 出血性および虚血性。動脈瘤や、動脈の破裂の後弱体化を伴う動静脈の故障により血管機能不全が引き起こされるときほとんどの場合、死につながる3出血性脳卒中と呼びます。血栓または塞栓は、血流を妨げ、脳の領域に酸素とグルコースの一時剥奪の原因と呼びます虚血性脳卒中4。影響を受ける地域や恒常性、代謝の不均衡、エネルギッシュな不全、神経細胞死および炎症5患者6生涯障害を誘発することができますに虚血性の芯線の周りの細胞に栄養を与えるに失敗しました。

虚血性脳卒中は多因子性傷害を含むいくつかの種類の細胞が反応し、異なる時点でその効果を発揮します。多くの相互作用は、個々 の細胞の挙動を調べるための困難な環境を作成します。だから、どのようにこのような複雑な環境下で特定のセルタイプの寄与を調べたか?虚血の認められた体外モデルは、平地の環境に、細胞の修復に続く一定の期間酸素とグルコースの剥奪 (OGD) へ細胞を公開するための構成されます。このシステムは、脳虚血再潅流をシミュレートします。この方法では細胞や組織が削除されるは特殊な低酸素室を用いた酸素環境のブドウ糖自由な媒体に公開されます。最大 24 h で、テストしたい仮説によって数分から OGD インキュベーション時間は異なります。研究が示している OGD 回数に応じて、平地環境、ストローク (すなわち、急性または亜慢性) の特定の表現型が実現できます。平地の条件に後部修復 OGD にさらされる主の孤立したアストロ サイトは、ストローク体外7を模倣するよく研究細胞モデルです。OGD を使用してストロークのような環境下での隔離されたセルの独立した分子メカニズムを明らかにすることができます。

アストロ生物学の知識が増えると、彼らがシナプスを維持し、神経の修復、開発、および可塑性8を維持するために重要なことは明白になりました。通常の条件下でアストロ サイトは解放し、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、gliotransmitters、新陳代謝のバランスとシナプス5,9内の恒常性を維持に対応します。虚血性脳卒中などの急性 neuroinflammation でこれらの細胞が反応になって、長期的な過剰発現のグリア線維性酸性タンパク質 (GFAP) を示し肥大の形態5,10,11,12. 虚血性梗塞が発展すると、アストロ サイトによって提供される恒常性、通常グルタミン酸取り込み、エネルギー代謝、活性と抗酸化活性13の交換に関する影響になります。

再アクティブ化されたアストロ サイトは、白血球の破壊領域14に向けて移行中周囲の梗塞組織増殖します。アストロ サイトの増殖は、増殖細胞核抗原 (PCNA)、キ67、ブロモデオキシウリジン (BrdU)15などのマーカーを使用して測定できます。この増殖応答が時間依存的に生成されます、それグリア瘢痕、外傷9後破損したサイトの実質に沿って不可逆的反応性アストロ サイトの配列を形成できます。この傷跡の初期の機能の 1 つはこの区域から免疫細胞漏出を制限します。しかし、研究では、傷跡が拡張、軸索の成長を阻害する分子をリリースおよび軸索が16患部の周りを拡張することを防ぐ物理的な障壁を作成する軸索の物理的な障害になることを示しています。それにもかかわらず、脊髄損傷後完全にグリア瘢痕の形成を防止するが17軸索の再生を損なうことができるを示す科学的な証拠があります。したがって、傷害の検討の枠組みに、測定する特定のアストロ サイトの応答コンテキストを考慮されなければなりません。

酸素無グルコース後アストロ サイトの個別の機能の研究に提示された方法論を適用できるし、調査官が答えたい質問に応じて変更することができます。たとえば、形態変化、OGD 時期を表明したマーカーのほか OGD にさらされているアストロ サイトから清さらに分析できる可溶性因子これらの細胞によって解放または評価するために調節されたメディアとして使用を識別するために、他の脳細胞に影響します。このアプローチにより、支配すると虚血性脳卒中のシナリオでその応答を調節する因子の解明につながる可能性がアストロ サイトの反応性に関する研究です。

Protocol

生後ラット (スプレイグ ドーリー) 1-4 日古い皮質を分離する使用されます。安楽死の方法は斬首、NIH ガイドラインで認められています。 1。 器具用材料手術準備 定置滅菌器オートクレーブ (温度: 121 ° c、圧力: 15 psi、時間: 30 分) スチール ボックスまたは瞬時滅菌袋のシールを使用。材料表 の材料を参照してください。 2。…

Representative Results

培養アストロ サイトの主な懸念の 1 つは、ニューロン、オリゴデンドロ サイト、線維芽細胞、ミクログリアなど他の細胞の存在です。図 1、ラット皮質から隔離されたセルごとに 3 日間メディアの変更があったし、か未処理または処理追加 LME 1, 24 時間後の細胞 GFAP の immunostained, DAPI で counterstained。未処理の細胞は、LME 処理細胞を示した 8% 陽?…

Discussion

このプロトコルでは、ラット皮質アストロ サイトの分離について説明します。このメソッドは、線維芽細胞、オリゴデンドロ サイト、ミクログリアなど他の細胞の種類と汚染を減らすために重要です。ミクログリアの数を減らすためには、いくつかの手順を取ることができる: メディア、揺れ、軌道と化学治療を変更します。選択的細胞マーカーを用いた蛍光抗体法によって、最も顕著な細…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者のテクニカル サポート パオラ ・ ロペス Pieraldi を感謝したいです。A.H.M. は助成金 8G12MD007600 と U54 NS083924 このパブリケーションをサポートに感謝しています。NIH NIMHD-G12 MD007583 助成施設支援に感謝いたします。D.E.R.A. は、NIHNIGMS R25GM110513 によって提供される交わりに感謝しています。共通の計測領域の使用のため感謝しております、博士プリシラ サナブリアの RCMI プログラムでの光イメージング施設の使用のための援助を与える G12MD007583。さらに、私たちは撮影・編集視覚的プロトコルの彼の顕著な役割のホセパディーヤを感謝したいと思います。

Materials

Instruments for Surgery – Step 1
Operating scissor 5.5” Roboz Company RS-6812 Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”  Roboz Company RS-5271 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”  Roboz Company RS-5882 Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp  Roboz Company RS-5095 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 Roboz Company RS-5135 Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers Roboz Company RS-4972 Peels brain meninges.
Dissection microscope Olympus SZX16 Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation – step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GibCo. Company 11995-065 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore Corning 431098
Astrocyte culture – step 3
Serological pipets 5mL VWR 89130-896 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL VWR 89130-898 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL VWR 89130-900 To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL Santa Cruz Biotechnology sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL Eppendorf 022363204
Barrier Tips 200 uL Santa Cruz Biotechnology sc-201725
Barrier Tips 1 mL Santa Cruz Biotechnology sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19" VWR 14220-048
60mm petri dishes Falcon 351007
Sterile gauze pads Honeywell Safety 89133-086
Stomacher 80 Biomaster Sewar Lab System 030010019 Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags Sewar Lab System BA6040 Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL Pyrex 1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60  Sigma-Aldrich Company S1020 To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 Sigma-Aldrich Company S3895 To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope Nikon Eclypse Ti-S Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks Falcon 353136
Multi-well plate Falcon 353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round VWR 48380-046
Bright-Line hemacytometer Sigma-Aldrich Company Z359629
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
Ethyl alcohol  Sigma-Aldrich Company E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) Sigma-Aldrich Company L1002 Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich Company C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 Sigma-Aldrich Company P0899
Trypsin/EDTA GibCo. Company 15400-054
Trypan Blue Sigma-Aldrich Company T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Sterile Water Sigma-Aldrich Company W3500
 OGD Medium Preparation – step 5
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose Sigma-Aldrich Company D5030 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine  GibCo. Company 25030-081 Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Filter System 50mL with 0.22um pore Corning 430320
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Single Flow Meter  Billups-Rothenberg SMF3001 Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber  StemCell 27310 Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter VWR 21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture Linde Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence – step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10% Sigma-Aldrich HT501128 Solution used to fix cells.
Methanol  Fisher A4544 Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100) Sigma-Aldrich T8787
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN Cell Signaling 24307 Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA Cell Signaling 2586 Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich Company P4170 Apoptosis staining.
Anti-Olig1 Abcam AB68105 Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+ Wako 016-20001 Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3  Sigma-Aldrich Company C9205 Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488 Molecular Probe Life Technology A1101 Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555 Molecular Probe Life Technology A21428 Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich Company D9542 Nuclear staining
Confocal microscope Olympus

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Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).

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