Elettroforesi capillare Separazione di anticorpo monoclonale Isoforme Utilizzando un capillare Neutral
Summary
Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Abstract
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
Introduction
Gli anticorpi monoclonali (MAK, MAB) sono proteine bioterapeutici con crescente interesse a causa della loro capacità di agire contro diverse malattie croniche e degenerative 1. Come altre biomolecole, mAbs sono inclini a subire numerose modifiche fisico in tutte le fasi del ciclo di vita (cioè dal biosintesi al prodotto finale). Tali modifiche includono, ma non sono limitati a: deamidation, glicosilazione, ossidazione, ciclizzazione, isomerizzazione, aggregazione e taglio proteolitico 2. Quindi, sono necessarie tecniche analitiche in grado di risolvere isoforme intrinseche per monitorare mAbs eterogeneità e stabilità per stabilire specifiche di qualità.
Elettroforesi capillare (CE) è una tecnologia di separazione ad elevate prestazioni realizzato OutInside di un tubo di silice fusa stretto (gamma micron) riempita con uno sfondo elettrolita (DTF). In seguito all'applicazione di un campo elettrico (fino a 30.000 V), molecola caricas migrano verso l'elettrodo con carica opposta (cioè la separazione elettro-driven). L'uso di alte tensioni in CE permette analisi veloci e maggiore efficienza, che sono superiori a elettroforesi su gel classica. Zona di elettroforesi capillare (CZE) è una tecnica basata CE-abitualmente utilizzati nel settore biofarmaceutico per la valutazione della qualità del prodotto 3-9. A differenza di altri modi di CE (ad esempio, gel elettroforesi capillare, capillare focalizzazione isoelettrica) o metodi di cromatografia basati, CZE può essere condotta senza utilizzare denaturanti o interfacce fase solida, permettendo l'analisi della eterogeneità dei mAbs vicino al loro stato nativo 10 . CZE separazione delle isoforme mAb verifica all'interno di un capillare in silice fusa coperta con un polimero idrofilo (capillare neutro) e si basa sulla diversa mobilità elettroforetica, che è governato dalla carica, massa, dimensioni e forma (o volume idrodinamico) 11. frazioni mAb vengono rilevati quandosono mobilizzati e passano attraverso la finestra di rilevamento, che è rilevato da un rivelatore ultravioletto (UV) assorbanza a 214 nm 4.
Il successo di questa tecnica analitica dipenderà la giusta attenzione ai dettagli, prima e durante l'esperimento. Agire altrimenti aumenterà il costo e il tempo per condurre l'analisi, in ultima analisi, che porta al fallimento costante e frustrazione.
Qui vi presentiamo una guida passo-passo per condurre un'analisi di successo di mAb eterogeneità CZE attraverso la spiegazione dettagliata della preparazione di soluzioni e campioni, la preparazione del sistema CE, i metodi dello strumento istituito, l'acquisizione dei dati, e l'elaborazione. Ai fini di questa esercitazione, un anti-fattore di necrosi tumorale alfa ricombinante completamente umano (anti-TNF) mAb è usato come proteina modello; Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per l'analisi di altre proteine considerando brevi modifiche. UNdditionally, diverse raccomandazioni per mitigare sono proposti potenziali problemi. Il lettore è incoraggiato a seguire rigorosamente il protocollo proposto, come la probabilità di successo aumenteranno.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo tutorial, si evidenzia l'importanza di pratiche corrette per lo svolgimento di analisi CZE di anticorpi monoclonali, al fine di aumentare la probabilità di avere successo. Tuttavia, quando CZE viene utilizzato su una base di routine, i problemi sorgono inevitabilmente 12.
Per ottenere i migliori risultati, è importante seguire le note che sono stati inclusi in tutto il protocollo, in quanto vi aiuterà l'analista a superare e risolvere i problemi passaggi diffi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Materials
| Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
| ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
| Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
| (Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
| 6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
| eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
| eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
| Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
| Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
| Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
| Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
| UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
| Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |
References
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