Summary

Aracı Olarak Etilen serbest Bileşik, 2-chloroethylphosphonic acid, kullanan Bakterilerin Etilen Yanıtı Eğitim için

Published: November 10, 2016
doi:

Summary

The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.

Abstract

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.

Introduction

Olefin (C2 lH 4) havagazı lambaları kullanılan bir laboratuarda yetiştirilir bezelye fide, (hipokotiller) daha kısa olduğu gövde olan bir anormal morfoloji sergilemiş olduğu gözlemlenmiştir, birinci 1901, bir bitki hormonu olarak tespit edilmiştir, daha kalın ve normal bezelye fide ile karşılaştırıldığında yan bükülmüş; Bir fenotip sonra üçlü cevap 1,2 olarak nitelendirdi. Daha sonraki çalışmalar, etilen gibi büyüme, stres yanıtı, meyve olgunlaşma ve yaşlanma 3. Arabidopsis thaliana, bitki biyolojisi araştırma için bir model organizma olarak çok sayıda gelişimsel süreçleri düzenleyen önemli bir fitohormondur, iyi etilen verdiği yanıtta açısından incelenmiştir olduğunu göstermiştir. Çeşitli etilen tepki mutantlar koyu yetişkin A'da görülen üçlü cevap fenotip istismar ederek izole edilmiştir etilen 1,4,5 mevcudiyetinde thaliana fideleri. bitkilerdeki etilen üretimi için biyosentetik ön-madde 1-a,minocyclopropane karboksilik asit (ACC) 6 ve yaygın olarak üç karşılık fenotipi 1,4,5 neden endojen, etilen üretimini geliştirmek için üçlü cevap deneyi sırasında kullanılır.

Etilen yanıtı yaygın bitkilerde çalışılan olmasına rağmen, bakteriler üzerinde eksojen etilen etkisi büyük ölçüde bitkiler ile bakterilerin yakın ilişki rağmen understudied edilir. Bir çalışmada, belirli Pseudomonas suşları karbon ve enerji 7'nin tek kaynağı olarak etilen kullanarak hayatta olduğunu bildirdi. Ancak, yalnızca iki çalışma bakteri etilen yanıt göstermiştir. İlk çalışma göstermiştir ki Pseudomonas aeruginosa, P. suşları fluorescens, P. putida ve P. syringae eriyik agaroz, saf etilen gazı 8 ile dengelenmiş bir kemotaksis tampon maddesi ile karıştırıldı olan bir agaroz tıkayıcı deneyi kullanılarak, etilen bakımından kemotaktik edildi. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, hiçbir Furth olmuşturSaf etilen gazı kullanılarak er raporları nedeniyle özel ekipman olmadan laboratuvarda gazların sevkinde güçlüğüne muhtemel bakteriyel etilen tepkisini, karakterize etmek. Bakteriyel etilen tepkisinin ikinci rapor etilen 9 xylinus meyve ilişkili bakteri Komagataeibacter (eski Gluconacetobacter) bakteriyel selüloz üretimi ve etkisinde gen ifadesini arttığını gösterdi. Bu durumda, etilen-salan bileşik, 2-chloroethylphosphonic asit (İEKB) saf etilen gazı ve özel ekipman ihtiyaç kalmaz, bakteriyel büyüme ortamında in situ etilen meydana getirmek üzere kullanıldı.

14, bir baz katalizörlü, birinci dereceden reaksiyon 12 boyunca pH 3.5 10,11 Yukarıdaki: 1 molar oranında İEHB 1 etilen üretir. CEPA bozunması pozitif Etil pH ve sıcaklık 13,14 ve sonuçlar ile ilişkilidiren, klorür ve fosfat. CEPA gaz etilen için uygun bir alternatif etilen bakteriyel yanıtları okuyan ilgilenen araştırmacılar sağlar.

Aşağıdaki protokoller genel amacı bakteriyel etilen tepkisini incelemek için basit ve etkili bir yöntem sağlamaktır ve bakteriyel büyüme ortamında CEPA'nın ayrışma etilen üretiminin fizyolojik olarak uygun seviyelerinin doğrulaması içerir, kültür pH analizi CEPA ayrışma sırasında zarar görmemesini sağlamak için bakteri üremesi ve bakteriyel morfoloji ve fenotip üzerindeki etilen etkisi değerlendirilmesi. Biz K. kullanarak bu protokolleri göstermek xylinus, bununla birlikte, bu protokoller uygun büyüme ortamı kullanılarak ve fenotip analizi diğer bakterilerde etilen tepkisini incelemek için adapte edilebilir.

Protocol

1. Kimyasallar 500 mM NaH 2 PO 4 · asitleştirildi içinde H2O (137,99 g / Mol) (pH 500 mM CEPA (144.49 gr / mol) ihtiva eden bir çözelti, ve her ikisi de, 500 mM NaCI (58.44 g / mol) 'den oluşan bir çözelti hazırlamak 2.5) ultra saf su ve 0.1 N HCI. çözümler açıktır kadar vorteks ile karıştırın. Seri olarak 5 mM ve 50 mM stok elde etmek için aynı çözücü (10 x) 500 mM seyreltik çözeltiler. Ultra saf su içinde 1-aminosiklopropan…

Representative Results

Üçlü cevap testi ile SH ortamında CEPA etilen kurtuluş (pH 7) doğrulanması için bir şematik plaka kurulum Şekil 1A gösterilmiştir – C. Zar protokolünü gösteren bir akış şeması Şekil 2'de Koyu-yetişkin A. gösterilir thaliana fideler ACC mevcudiyetinde ve SH ortamı Cepa ayrışma yoluyla üretilen etilen (pH 7) varlığında üçlü cevap fenotipi (abartılı apikal kancalı daha kısa ve daha k…

Discussion

Burada tarif edilen yöntemler modeli organizma, K. kullanılarak bakteriyel etilen tepkisinin incelenmesi için CEPA etilenin in situ üretimini anahat xylinus. Etilen bir pH'a CEPA saf etilen gazı veya özel laboratuar ekipmanı ihtiyacını ortadan sahip daha büyük 3.5 10,11 sahip herhangi bir sulu ortam ilave üretilebilir Bu yöntem çok yararlıdır. Bu yöntem, bakterilerin Cepa türetilmiş Etilenin etkilerini incelemek ile sınırlı değildir, aynı zamanda ökaryot…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.

Materials

1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) Sigma A3903 Biosynthetic precursor of ethylene in plants
4-sector Petri dish Phoenix Biomedical CA73370-022 For testing triple response
Agar BioShop AGR001.1 To solidify medium
Canon Rebel T1i DLSR camera Canon 3818B004 For pictures of pellicles
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921  Sigma C2730 Aqueous solution
Citric acid BioShop CIT002.500 For SH medium
Commercial bleach Life Brand 57800861874 Bleach for seed sterilization
Concentrated HCl BioShop HCL666.500 Hydrochloric acid for pH adjustment
Digital USB microscope Plugable N/A For pictures of colonies
Ethephon (≥ 96%; 2-chloroethylphosphonic acid) Sigma C0143 Ethylene-releasing compound
Glucose BioBasic GB0219 For SH medium
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 ATCC 53582 Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium
Microcentrifuge tube LifeGene LMCT1.7B 1.7 mL microcentrifuge tube
Murashige and Skoog (MS) basal medium  Sigma M5519 Arabidopsis thaliana growth medium
Na2HPO4·7H2O  BioShop SPD579.500 Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium
NaCl BioBasic SOD001.1 Sodium chloride for saline and control solution
NaH2PO4·H2O  BioShop SPM306.500 Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution
NaOH BioShop SHY700.500 Sodium hydroxide for pH adjustment
Paraffin film Parafilm PM996 For sealing plates and flasks
Peptone (bacteriological) BioShop PEP403.1 For SH medium
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific 3900 Bacterial cell counting chamber
Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm VWR 28145-501 For sterilizing cellulase
Sucrose BioShop SUC600.1 Sucrose for MS medium
Yeast extract BioBasic G0961 For SH medium

References

  1. Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
  2. Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
  3. Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
  4. Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
  5. Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
  6. Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
  7. Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
  8. Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
  9. Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).
  10. Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
  11. Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
  12. Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
  13. Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
  14. Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  16. Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. Amorphous cellulose-structure and characterization. Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).

Play Video

Cite This Article
Augimeri, R. V., Varley, A. J., Strap, J. L. Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria. J. Vis. Exp. (117), e54682, doi:10.3791/54682 (2016).

View Video