Utilizando o composto libertador de etileno, ácido 2-cloroetilfosfônico, como uma ferramenta para estudar a resposta do etileno em bactérias
Summary
The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.
Abstract
Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.
Introduction
O etileno olefina (C 2 H 4) foi descoberto pela primeira vez como uma hormona vegetal, em 1901, quando foi observado que as mudas de ervilha, cultivadas em laboratório que utilizadas lâmpadas de gás de carvão, exibiu uma morfologia anormal em que hastes (hipocótilos) eram mais curtos, mais espessa e inclinou-se para os lados em relação às plantas de ervilha normais; um fenótipo mais tarde denominado a 1,2 resposta tripla. Estudos posteriores demonstraram que o etileno é um hormônio vegetal vital que regula vários processos de desenvolvimento como o crescimento, a resposta ao estresse, o amadurecimento dos frutos e senescência 3. Arabidopsis thaliana, um organismo modelo para a investigação biologia vegetal, tem sido bem estudada em relação à sua resposta ao etileno. Mutantes de resposta Vários etileno foram isolados, explorando o fenótipo triplo resposta observada em dark-grown A. mudas thaliana na presença de etileno 1,4,5. O precursor biossintético para a produção de etileno em plantas é 1-Aácido minocyclopropane carboxílico (ACC) e 6 é comumente utilizado durante o ensaio de resposta tripla para aumentar a produção endógena de etileno que conduz ao fenótipo triplo 1,4,5 resposta.
Embora a resposta ao etileno é amplamente estudada em plantas, o efeito do etileno exógeno em bactérias é muito pouco estudada, apesar da estreita associação de bactérias com plantas. Um estudo relatou que certas estirpes de Pseudomonas pode sobreviver usando etileno como única fonte de carbono e energia 7. No entanto, apenas dois estudos demonstraram que as bactérias responder ao etileno. O primeiro estudo mostrou que as estirpes de Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, e P. syringae foram quimiotáctica para etileno utilizando um ensaio de tampão de agarose no qual agarose fundida foi misturada com um tampão de quimiotaxia equilibrada com etileno puro gás 8. No entanto, a nosso conhecimento, não houve nenhum further relatórios que utilizam gás de etileno puro para caracterizar a resposta de etileno bacteriana, provavelmente devido à dificuldade de manipulação de gases no laboratório sem equipamento especializado. O segundo relatório de resposta ao etileno bacteriana demonstrou que o etileno aumento da produção de celulose bacteriana e expressão do gene influenciado na bactéria associada à fruta, Komagataeibacter (anteriormente Gluconacetobacter) xylinus 9. Neste caso, o composto libertador de etileno, ácido 2-cloroetilfosfônico (CEPA) foi utilizado para a produção de etileno in situ no interior do meio de crescimento bacteriano, evitando a necessidade de gás de etileno puro ou equipamento especializado.
CEPA produz etileno numa proporção de 1: 1 molar de pH acima de 3,5 através de um 10,11 catalisada por base, a reacção de primeira ordem 12-14. A degradação do CEPA é positivamente correlacionada com o pH e temperatura 13,14 e resulta na produção de acetatoeno, cloreto e fosfato. CEPA fornece aos pesquisadores interessados em estudar respostas bacterianas etileno com uma alternativa conveniente para o etileno gasoso.
O objectivo global dos seguintes protocolos é fornecer um método simples e eficaz para estudar a resposta de etileno bacteriana e inclui a validação de níveis f isiologicamente relevantes de produção de etileno a partir de decomposição CEPA em meio de crescimento bacteriano, análise de pH da cultura para garantir CEPA decomposição não é prejudicada durante crescimento bacteriano, e avaliação do efeito do etileno na morfologia bacteriana e fenótipo. Nós demonstramos esses protocolos usando K. xylinus, no entanto, estes protocolos podem ser adaptados para estudar a resposta ao etileno nas outras bactérias, utilizando o meio de crescimento apropriado e analisa fenótipo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos aqui descritos descrevem a produção in situ de etileno a partir de CEPA para o estudo da resposta ao etileno bacteriana usando o organismo modelo, K. xylinus. Este método é muito útil como o etileno pode ser produzido, completando qualquer meio aquoso que tem um pH maior do que 3,5 com 10,11 CEPA eliminando a necessidade de gás de etileno puro ou equipamentos de laboratório especializado. Este método não se limita ao estudo dos efeitos do etileno derivado de CEPA em bact…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.
Materials
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥ 96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 mL microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
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