Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na<em> Brucella</em> A infecção de células HeLa

Espécies de Brucella são gram-negativas, agentes patogénicos intracelulares facultativos que pertencem à classe de α-Proteobacteria. Eles causar abortos e infertilidade em seus hospedeiros naturais, tais como gado, cabras, ou ovelhas, resultando em graves perdas económicas em áreas endêmicas. A brucelose é uma das doenças zoonóticas mais importantes do mundo, causando mais de meio milhão de novas infecções humanas por ano ^1. A transmissão para humanos é mais comumente causada por contato direto com animais infectados ou pela ingestão de alimentos contaminados, como leite não pasteurizado. Os sintomas da doença são febril inespecífica, o que provoca dificuldades no diagnóstico de brucelose. Se não forem tratados, os pacientes podem desenvolver uma infecção crónica com sintomas mais graves, tais como a artrite, endocardite, e neuropatia ^2.

No nível celular Brucella é capaz de invadir células fagocíticas e não fagocíticas e replica no interior de uma intracelularcompartimento conhecido como o Brucella molecular contendo vacúolo (BCV). Internalização de bactérias requer rearranjos do citoesqueleto de actina por Rac, Rho, e ativação direta de Cdc42 ^3. Dentro da célula hospedeira eucariótica, o BCV transita ao longo da via endocítica e apesar da interacção com os lisossomas, bactérias conseguem evitar a degradação ^4. A acidificação do BCV pelo vesicular ATPase é necessária para induzir a expressão do sistema de secreção de tipo IV bacteriana (T4SS) ^5. Acredita-se que efectores bacterianas secretadas pela T4SS são essenciais para Brucella a estabelecer o seu nicho replicativa, uma vez que a deleção de ⁶ T4SS ou inibição da ATPase de chumbo vesicular a defeitos no estabelecimento do nicho intracelular ^7. As bactérias não replicar durante a fase de tráfico até que eles alcançar um compartimento vacuolar derivada de ^ER-8. Uma vez que a proliferação ocorre intracelular, o BCV é encontrado em CLose associação com marcadores, tais como ER calnexina e glucose-6-fosfatase ^6.

Os mecanismos moleculares pelos quais Brucella entra nas células, evita a degradação lisossomal, e, finalmente, se replica em um compartimento do ER semelhante permanecer em grande parte desconhecida. Fatores do hospedeiro envolvidos em diferentes etapas de infecção foram principalmente identificado por abordagens específicas ou uma interferência tela pequena escala pequena RNA (siRNA), realizado em células de Drosophila ^9. Estes têm lançar luz sobre a contribuição de fatores do hospedeiro individuais durante a infecção Brucella mas ainda estamos longe de uma compreensão abrangente de todo o processo.

Aqui, os protocolos que permitem a identificação de factores do hospedeiro humano com RNA de interferência de rastreio em larga escala (RNAi) em combinação com a microscopia de fluorescência de campo amplo automatizado e de análise de imagem automatizada são apresentados. Reverso transfecção siRNA de células HeLa é realizada como describEd anteriormente com modificações menores ^10,11. O ensaio endpoint abrange uma grande parte do ciclo de vida intracelular Brucella, exceto a saída e a infecção das células vizinhas. Para caracterizar ainda mais os hits identificadas no ensaio de ponto final, um protocolo modificado para identificar factores envolvidos nos passos iniciais da infecção é utilizado.

Uma estirpe de Brucella abortus, que expressa constitutivamente GFP é utilizado para o ensaio de ponto final em que as bactérias são permitidos para infectar as células durante dois dias. Durante este tempo, as bactérias entram nas células, o tráfego para o nicho de replicação derivada de ER, e replicam no espaço peri-nuclear. Os altos níveis de sinal de GFP podem então ser usadas para detectar com fiabilidade as células individuais que contêm bactérias replicantes.

Para estudar a entrada de Brucella num ensaio de elevado rendimento, é importante ser capaz de distinguir entre as bactérias intracelulares e extracelulares. O método aqui apresentado circumventos coloração de anticorpos diferencial de bactérias intracelulares e extracelulares. Ele baseia-se numa estirpe que expressa uma GFP Brucella induzível por tetraciclina em combinação com a expressão constitutiva de dsRed. A presença de um marcador dsRed constitutivo permite a identificação de todas as bactérias que estão presentes na amostra. expressão da GFP é induzida através da adição de tetraciclina anidrotetraciclina o análogo não-tóxico (ATC), simultaneamente com a inactivação de bactérias extracelulares por gentamicina (Gm). Enquanto o antibiótico Gm célula impermeável mata as bactérias extracelulares, atc pode entrar na célula hospedeira e induzir a expressão da GFP selectivamente em bactérias intracelulares. Esta dupla repórter permite a separação robusto de bactérias intracelulares individuais (GFP e de sinal dsRed) de bactérias extracelulares (somente sinal dsRed) por microscopia de campo amplo. De modo a alcançar a expressão da GFP intracelular detectável por Brucella verificou-se que 4 horas de indução por ATC resulta em um relisinal de poder. Esquemas de indução similares para expressar seletivamente GFP em bactérias intracelulares tem sido usado anteriormente para estudar Shigella intracelular ^12.