מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em> Brucella</em> זיהום של תאים הלה
Summary
Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.
Abstract
מיני Brucella הם פתוגנים תאיים פקולטטיבי מדביקי חיות כמארחים הטבעיים שלהם. הילוכים לבני האדם נגרמים לרוב על ידי מגע ישיר עם בעלי חיים נגועים או על ידי בליעה של מזון מזוהם והוא יכול לגרום לזיהומים כרוניים קשים.
Brucella יכול לפלוש תאים phagocytic המקצועיים והלא-מקצועיים משכפל בתוך reticulum endoplasmic (ER) vacuoles -derived. הגורמים המארחים הנדרשים לשם כניסת Brucella לתוך תאי מארחים, הימנעות שפלת lysosomal, ושכפולים בתא ER-כמו להישאר אלמונים למדי. כאן אנו מתארים שני מבחנים לזהות גורמי מארח מעורבים כניסת Brucella ושכפול בתאים הלה. הפרוטוקולים מתארים את השימוש של התערבות RNA, בעוד שיטות הקרנה חלופיות יכולות להיות מיושמות. המבחנים מבוסס על זיהוי של חיידקים שכותרתו fluorescently שכותרתו fluorescently תאי מארח באמצעות אוטומטימיקרוסקופיה רחב בתחום. התמונות פלורסנט מנותחות באמצעות צינור ניתוח תמונה סטנדרטי CellProfiler המאפשר ניקוד זיהום מבוסס תא בודד.
ב assay נקודות הקצה, שכפול תאיים נמדד ימים לאחר ההדבקה. זה מאפשר לחיידקי תנועת הנישה בשכפול הדנ"א שלהם שבו התפשטות הוא יזם כ -12 שעות לאחר כניסת חיידקים. Brucella אשר הקים בהצלחת נישה תאית יהיה וכך התרבו מאוד בתוך תאי מארחים. מאז חיידקים תאיים יהיה מאוד במספרם חיידקים תאיים או תאיים בודדים שאינם בשכפול הדנ"א, זן המבטאים constitutively GFP יכול לשמש. אות GFP החזקה לאחר מכן נעשתה שימוש כדי לזהות תאים נגועים.
לעומת זאת, עבור assay הכניסה חיוני להבדיל בין תאיים ובקטריות התאיות. הנה, קידוד זן עבור GFP טטרציקלין מושרה משמש. הַשׁרָאָהשל GFP עם איון סימולטני של חיידקים תאיים על ידי גנטמיצין מאפשרת הבחנה בין תאיים ובקטריות תאיים על פי האיתות GFP, עם חיידקים תאיים רק להיות מסוגל להביע GFP. זה מאפשר זיהוי החזק של חיידקים תאיים יחידים לפני התפשטות תאית היא יזמה.
Introduction
מיני Brucella הם גראם שליליים, פתוגנים תאיים פקולטטיבי השתייכות למעמד של α-פרוטאובקטריה. הם לגרום הפלות פוריות אצל מארחיהם טבעיים כגון בקר, עזים או כבשים וכתוצאה מכך הפסדים כלכליים חמורים באזורים אנדמיים. ברוצלוזיס היא אחת מחל zoonotic החשובות ביותר בעולם גורמים יותר מחצי מיליון זיהומי אדם חדשים מדי שנת 1. הילוכים לאדם נגרמים לרוב על ידי מגע ישיר עם בעלי חיים נגועים או על ידי בליעה של מזון מזוהם כמו חלב לא מפוסטר. הסימפטומים של המחלה חום הם נוקבים, הגורמת לקשיים באבחון של ברוצלוזיס. בהעדר טיפול, חולים יכולים לפתח דלקת כרונית עם תסמינים חמורים יותר כגון דלקת פרקים, דלקת פנים הלב, וכן נוירופתיה 2.
ברמה התאית Brucella הוא מסוגל לפלוש תאים phagocytic והלא phagocytic משכפל בתוך תאייםתא המכונה vacuole המכילים Brucella (BCV). הפנמה של חיידקים דורש rearrangements cytoskeleton אקטין ידי RAC, Rho, והפעלה ישירה של Cdc42 3. בתוך התא המארח איקריוטיים, את BCV traffics לאורך מסלול endocytic ולמרות אינטראקציה עם lysosomes, חיידקים מצליחים למנוע השפלה 4. החמצה של BCV ידי שלפוחי ATPase נדרש כדי לגרום הביטוי של מערכת הפרשת IV סוג בקטריאלי (T4SS) 5. הוא האמין כי effectors חיידקי מופרש T4SS חיוני Brucella להקים הנישה בשכפול הדנ"א שלו, מאז מחיקה של T4SS 6 או עיכוב של עופרת ATPase שלפוחי מפגמי הקמת הנישה התאית 7. חיידקים אינם משתכפלים במהלך שלב של סחר עד שהם להגיע תא vacuolar הנגזרות ER 8. לאחר התפשטות תאיים מתרחשת, BCV נמצא CLעמותת OSE עם סמני ER כגון calnexin וגלוקוז-6-phosphatase 6.
המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו Brucella נכנס לתאים, נמנע שפלת lysosomal, ולבסוף משכפל ב תא ER-כמו להישאר אלמונים למדי. גורמי מארח מעורבים שלבים שונים של זיהום זוהו בעיקר על ידי גישות ממוקדות או מסך RNA התערבות קטן בקנה מידה קטנה (siRNA) בצע בתאים תסיסנית 9. אלה שפכו אור על תרומתם של גורמים ממארחים במהלך הדבקת Brucella אבל אנחנו עדיין רחוקים הבנה מקיפה של התהליך כולו.
הנה, פרוטוקולים המאפשרים זיהוי של גורמי מארח אנושיים באמצעות התערבות RNA בקנה מידה גדולה (RNAi) הקרנה בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום אוטומטי ניתוח תמונה אוטומטי מוצגים. transfection siRNA ההפוך של תאים הלה מבוצע described קודם לכן 10,11 עם שינויים קלים. את assay קצה מכסה חלק גדול של מחזור החיים התאיים Brucella למעט היציאה והזיהום של תאי שכנים. כדי להמשיך לאפיין את הנפילות ב assay נקודות הקצה, פרוטוקול שונה כדי לזהות גורמים הכרוכות בביצוע הפעולות הראשונות של הזיהום משמש.
זן abortus Brucella כי constitutively מבטא GFP משמש עבור assay הסיום שבו חיידקים מותרים להדביק תאים במשך ימים. במהלך תקופה זו, חיידקים לחדור לתאים, תנועה לנישה בשכפול הדנ"א הנגזרות ER, לשכפל במרחב פרי-גרעיני. הרמות הגבוהות של אות ה- GFP לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לזהות תאים בודדים מהימן אשר מכילים חיידקים משכפלים.
כדי ללמוד כניסת Brucella ב assay תפוקה גבוהה, חשוב להיות מסוגל להבחין בין חיידקים תאיים תאיים. השיטה המוצגת כאן circumvמכתים נוגדן הפרש המציג של חיידקים תאיים תאיים. היא מבוססת על זן Brucella להביע GFP טטרציקלין מושרה בשילוב עם ביטוי המכונן של dsRed. הנוכחות של סמן dsRed מכונן מאפשרת זיהוי של כל החיידקים שנמצאים במדגם. ביטוי של GFP הוא המושרה על ידי תוספת של anhydrotetracycline אנלוגי טטרציקלין רעיל (ATC) בו זמנית עם איון של חיידקים תאיים על ידי גנטמיצין (GM). בעוד תא-חדיר אנטיביוטי Gm הורג חיידקים תאיים, ATC יכול להיכנס לתא המארח להשרות ביטוי של GFP סלקטיבי חיידקים תאיים. כתב כפול זה מאפשר הפרדה החזקה של חיידקים תאיים יחידים (GFP אות dsRed) מחיידקים תאיים (אות DsRed בלבד) באמצעות מיקרוסקופ השדה רחב. כדי להגיע ביטוי GFP לזיהוי על ידי Brucella תאיים מצאנו כי 4 שעות של אינדוקציה ידי ATC התוצאה היא רליאות מסוגל. תוכניות אינדוקציה דומות להביע GFP סלקטיבי חיידקים תאיים כבר השתמשו בעבר כדי ללמוד Shigella התאי 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacterial pathogens have evolved numerous strategies to manipulate eukaryotic host cells to their benefit. Pathogens causing acute infections often show rapid proliferation which is accompanied by significant alarming of the immune system and loss of viability of infected cells. In contrast, Brucella and other pathogens that cause chronic infections manage to establish long-lasting interactions within host cells. Therefore, bacteria need to fine tune host cell functions to their benefit without disrupting cellul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants 51RT 0_126008 and 51RTP0_151029 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX and TargetInfectX, respectively, in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology. We acknowledge grant 310030B_149886 from the Swiss National Science Foundation (SNSF). Work of S.H.L and A.C. was supported by the International PhD Program “Fellowships for Excellence” of the Biozentrum. Simone Muntwiler is acknowledged for technical assistance. We would like to thank Dirk Bumann for providing pNF106 and Jean Celli for pJC43 and pJC44.
Materials
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used. |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 ug/ml solution in 100% ethanol is kept at -20°C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20°C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTTTTGAATTCTGGCAATTCCGACGTCTAAGAAACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTTTTGTCGACTTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10x objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20mm, DIC Prism: 10x, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1392 x 1040 imaging pixels, 6.45 x 6.45-µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25×36 |
References
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
- Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
- Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
- Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
- Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
- Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
- Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
- Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
- Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
- Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
- Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
- von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
