This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.
Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.
Om de voedingsstoffen die nodig zijn om te overleven verkrijgen maligne tumoren is toegang tot de bloedstroom van de patiënt. Die toegang krijgen tumorcellen vrijkomen chemische signalen die de groei van nieuwe bloedvaten te stimuleren om de tumor, waardoor kaping het normale fysiologische proces dat angiogenese 2. Het is ook via de bloedvaten aangemaakt via angiogenese dat metastase (dat wil zeggen de verspreiding van kanker naar andere organen) optreden. Omdat het proces van angiogenese is zo belangrijk om de progressie van een dergelijke grote verscheidenheid aan kankers, is een aantrekkelijk doel in antikanker therapie onderzoek 3.
Eén methode gebruikt om angiogenese te kwantificeren het vermogen van de endotheliale progenitor cel buizen vormen meten wanneer geplaatst op een extracellulaire matrix. Vanwege de vorming van deze buizen is een belangrijke eerste stap in angiogenese, testing omgevingsomstandigheden (bijvoorbeeld aan- of afwezigheid van een bepaald compound), die kunnen stimuleren of remmen de vorming van de buis geeft inzicht in de specifieke stappen die kunnen worden gericht op angiogenese te remmen. De endotheelcel buisvorming assay is een van de meest gebruikte 4 in vitro werkwijzen die de cellen in staat buizen te vormen meet. Het is een eenvoudige test, die weinig componenten en een korte kweekperiode 5. Misschien nog belangrijker is echter dat de opgedane dergelijke analysegegevens meetbaar.
Een voorbeeld van het gebruik van de vaatvorming bepaling omvat het vergelijken van de ontwikkeling van buizen uit vasculaire endotheelcellen gekweekt op extracellulaire matrix vs. groeifactor verlaagd (GFR) extracellulaire matrix. De extracellulaire matrix is een basale membraan-materiaal geïsoleerd uit cellen en sarcoom belangrijkste componenten laminine, type IV collageen, groeifactoren en proteoglycanen. Enkele verbindingen hebben verschillende effecten op het vermogen van de cel om buizen te vormen wanneer ineen door verlaging groeifactoren en verminderde heparansulfaatproteoglycanen (HSPG). HSPGs zijn een component van de extracellulaire matrix die aanzienlijk GFR extracellulaire matrix wordt verminderd. Als voorbeeld, indien de hypothese dat angiogenese remmers, zoals SB225002, welke blokken het CXCR2 receptor aanzienlijk zwakker vermogen vaatvorming als HSPGs overvloedig onderbreken, dan een vergelijking tussen buisvorming activiteit in de extracellulaire matrix en GFR extracellulaire matrix belang in het verkennen van de mogelijkheid van angiogenese remming via de controle van HSPGs.
Andere tests die vaak worden gebruikt om de effecten van verbindingen op angiogenese te bepalen in vivo. Bekende voorbeelden hiervan zijn de chick chorion-membraan (CAM) assay 6 met behulp van kippeneieren, en de in vivo Matrigel plug angiogenese assay 7 met behulp van muizen. Terwijl in vivo methoden meten angiogenese in tRIE afmetingen en zijn representatief voor het menselijk lichaam vergeleken met de in vitro assay buisvorming ondervinden zij tekortkoming dat er beduidend meer tijd en aanzienlijk moeilijker uit te voeren. Zowel de CAM-bepaling en de extracellulaire plug assay Neem minstens een week 8 te doen, terwijl in vergelijking, de vaatvorming assay worden uitgevoerd in een enkele dag en het vereist niet het gebruik van dieren.
Het is belangrijk op te merken dat de endotheelcellen die in dit rapport zijn humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC). Deze cellen spelen een belangrijke rol in vasculaire ontkiemen en groei van bloedvaten en voldoende analoog aan endotheelcellen in kankers worden gebruikt voor anti-angiogenese activiteit evalueren zowel in vitro als in vivo experimenten 9. Andere cellen zoals primaire microvasculaire endotheliale cellen kan ook worden gebruikt.
Het is ook belangrijk op te merken dat naast het hebben lagereHSPGs niveaus van de GFR extracellulaire matrix heeft ook de niveaus van veel componenten in vergelijking met normale extracellulaire matrix. Dit omvat, maar is niet beperkt tot: EGF, IGF-1, PDGF en TGF-beta. Die het uitvoeren van experimenten bestuderen de betekenis van deze verbindingen ten opzichte van angiogenese interessant kunnen gebruik GFR extracellulaire matrix.
Bij het uitvoeren van deze test, is het essentieel om de extracellulaire matrix op ijs of bij 4 ° C te allen tijde, tenzij anders vermeld. Als de extracellulaire matrix opwarmen boven 4 ° C, zal polymeriseren, en de test wordt geruïneerd. Het is ook belangrijk dat alles wat in contact komt waarborgen (bijvoorbeeld pipetpunten, de plaat) met de extracellulaire matrix voorgekoeld voor bovengenoemde reden. Het aantal cellen geënt in elk putje slecht is, wordt te weinig cellen niet de verwachte web die in het controlemonster, te veel cellen grote celclusters of een monolaag vormen en de test niet geldig. Een andere belangrijke factor in het succes van deze test is de cel passage nummer van de HUVEC. De passage nummer moet altijd lager zijn dan tien, anders robuuste buis formatie mag niet optreden. Bovendien moet men ervoor zorgen dat het celkweekmedium gebruikt niet is verstreken of de cellen niet levensvatbaar zijn. Alternattend, kan men het medium en zijn onderdelen aliquot en bewaar ze bij -20 ° C te bewaren gedurende een periode na de vervaldatum. Natuurlijk is het nog steeds de voorkeur om het medium vóór gebruik de vervaldatum
Zoals alle procedures, zijn er een aantal nadelen aan het uitvoeren van de endotheelcel vaatvorming assay. Een groot probleem is dat, omdat er verschillende soorten van endotheelcellen en dragermatrices, de resultaten van de test kan sterk variëren afhankelijk van het soort cel en matrix wordt gebruikt. De endotheelcellen gebruikt (HUVECs, HAECs of HMVECs) zijn primaire cellen, ze zijn duur om variabiliteit en hebben in vergelijking met onsterfelijk gemaakte cellen. De primaire cellen beperkt doorgangen voor gebruik, en zijn daarom niet geschikt voor langdurige angiogenese experimenten 14. Voor betrouwbare gegevensopslag moet men altijd dezelfde types voor de test. Net als bij andere in vitro assays, moeten de resultaten van een assay vaatvorming conbevestigd in vivo, omdat de resultaten van gecontroleerde en kunstmatige omstandigheden tweedimensionale weefselcultuur niet altijd worden weerspiegeld in het complex biosysteem van een levend organisme. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat dit type assay kan alleen worden gebruikt om endotheelcellen buisvorming tonen, en mag niet worden gebruikt om andere niet-endotheliale testen buis vormende cellen.
Deze test is een vrij eenvoudige en snelle methode om angiogene potentieel van een verbinding te kwantificeren. Het vormt ook een platform voor verdere experimenten, zoals alleen, is het geen gegevens over de specifieke mechanisme waarmee de verbinding daadwerkelijk het vaartuig vormingsproces beïnvloedt verkregen. Echter, het gebruik van verschillende extracellulaire matrix is een voorbeeld van hoe je een kader voor onderzoek vragen die niet vaak wordt gebruikt verder te creëren. Er zal gaan specifieke biochemische mechanismen van de compound die specifieke remmers die onderdelen van doelgerichte studiede angiogenese route. Een andere benadering kan zijn om RNA te extraheren uit de endotheelcellen en gebruik RT-PCR (Real Time PCR) 12 tot veranderingen in de genexpressie die de groei gedrag waargenomen in de assay kan veroorzaken analyseren. Toekomstige toepassingen van deze methode zijn getransfecteerde HUVEC knock-down assays voor specifieke stappen van de angiogenese route te creëren. Er zijn mogelijkheden om deze benadering van de lymfevatontwikkeling route bestuderen van toepassing. Door het veranderen van extracellulaire matrixcomponenten, kan de interactie tussen matrix en celprocessen ondersteunen angiogenese bij kanker nader worden toegelicht. De extractie van RNA en eiwitten door endotheelcellen onder deze specifieke omstandigheden aanvullende kwantificeerbare corresponderend met dataverwerking.
The authors have nothing to disclose.
The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.
EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm in 37 oC before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 oC , warm in 4 °C before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 oC, warm in 4 °C before use. |
SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 oC, warm in room temperature before use. |
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 oC, warm in 37 oC before use. |
Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |