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의학

Endotelial estratégica Assay formação de células do tubo: Comparando Matriz Extracelular e Fator de Crescimento Reduzido Matriz Extracelular

Published: August 14, 2016
doi:
10.3791/54074
, , , ,
1Center for Molecular Medicine and Genetics (CMMG),Wayne State University School of Medicine, 2Department of Surgery,Wayne State University School of Medicine, 3Department of Oncology,Wayne State University School of Medicine

Summary

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Abstract

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

Introduction

A fim de obter os nutrientes necessários para a sobrevivência, tumores malignos requerem acesso à corrente sanguínea do paciente. Para obter esse acesso, as células tumorais libertar sinais químicos que estimulam o crescimento de novos vasos sanguíneos no tumor, sequestrando assim o processo fisiológico normal conhecido como angiogénese 2. É também através dos vasos sanguíneos criados através de angiogénese que a metástase (isto é, a propagação do cancro para outros órgãos) pode ocorrer. Uma vez que o processo de angiogénese é tão vital para a progressão de uma grande variedade de cancros, é um alvo atractivo na investigação terapia antineoplásica 3.

Um dos métodos utilizados para quantificar a angiogénese é medir a capacidade da célula endotelial progenitor para formar tubos quando colocado sobre uma matriz extracelular. Uma vez que a formação desses tubos é um passo crítico na angiogénese precoce, teste de condições ambientais (por exemplo, presença ou ausência de um determinado acordompound) que pode estimular ou inibir a formação do tubo fornece insights sobre os passos específicos que podem ser direcionados para inibir a angiogênese. O ensaio de formação de tubo de células endoteliais é um dos 4 métodos mais amplamente utilizados in vitro que mede a capacidade das células para formar tubos. É um ensaio simples, que requer relativamente poucos componentes e um período de cultura de curto 5. Talvez mais importante, no entanto, é que os dados obtidos a partir deste tipo de ensaio é quantificável.

Um exemplo para a utilização do ensaio de formao de tubo consiste em comparar o desenvolvimento de tubos a partir de células endoteliais vasculares cultivadas em matriz extracelular contra o factor de crescimento reduzida (TFG) da matriz extracelular. A matriz extracelular é um material de membrana do tipo cave isolado a partir de células de sarcoma e os seus principais componentes são laminina, colagénio tipo IV, factores de crescimento e proteoglicanos. Alguns compostos têm diferentes efeitos sobre a capacidade da célula para formar tubos quando emum ambiente com fatores de crescimento reduzidas e reduzidas proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPGs). HSPGs são um componente da matriz extracelular que é significativamente reduzida em TFG matriz extracelular. Como um exemplo, se a hipótese é a de que os inibidores de angiogénese, tais como SB225002, que bloqueia o receptor CXCR2, têm capacidade consideravelmente mais fraca para interromper a formação do tubo quando HSPGs são abundantes, em seguida, uma comparação entre a actividade de formação do tubo na matriz extracelular e a TFG matriz extracelular é importante em explorar a possibilidade de inibição da angiogênese através do controle de HSPGs.

Outros ensaios que são vulgarmente utilizados para determinar os efeitos dos compostos sobre a angiogénese são métodos in vivo. Exemplos notáveis ​​disto são o pinto membrana corioalant�ca (CAM) Ensaio 6 usando ovos de galinha, eo in vivo Matrigel ligar ensaio de angiogénese 7 utilizando camundongos. Enquanto os métodos in vivo medir a angiogénese em três dimensões e são mais representativas do corpo humano em comparação com o ensaio de formação in vitro de tubo, eles sofrem o defeito de que requer muito mais tempo e é consideravelmente mais difícil de executar. Tanto o ensaio de CAM e o ensaio de tampão extracelular demorar pelo menos uma semana 8 para fazer, enquanto que na comparação, o ensaio de formação de tubo pode ser feito de um único dia e que não requer o uso de animais.

É importante notar que as células endoteliais usadas neste relatório são células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). Estas células desempenham um papel chave em broto vascular e o crescimento de vasos sanguíneos, e são suficientemente semelhante às células endoteliais em cancros a ser utilizado para avaliar a actividade anti-angiogénese, tanto in vitro e in vivo 9. podem também ser utilizadas outras células, tais como células endoteliais microvasculares primárias.

É também importante notar que, além de ter baixaníveis de HSPGs, a matriz extracelular de GFR também tem níveis reduzidos de muitos componentes, quando comparado com a matriz extracelular normal. Isto inclui, mas não está limitado a: EGF, IGF-1, PDGF e TGF-beta. Esses realização de experimentos que estudam o significado destes compostos em relação à angiogênese pode estar interessado em usar GFR matriz extracelular.

Protocol

Cultura 1. celular Semente 3×10 5 células HUVEC em 10 ml de meio de crescimento completo 10 em um frasco de 75 cm. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO 2 a 70-80% de confluência. 2. ensaio de formação de túbulos Descongelar ou o crescimento da matriz extracelular reduzida-fator (TFG) ou matriz extracelular normal, durante a noite em gelo a 4 ° C. Nota: Por uma questão de brevidade 'matriz extracelular' passarão a ser usado para fazer referência tanto TFG e matriz extracelular normal. O processo para prepará-los é idêntico. Mantenha a placas de cultura de 96 poços sobre gelo, e adicionar 50 ul de matriz extracelular refrigerada por poço usando pontas pré-arrefecida. Prepare triplicado de 5 poços contendo apenas a matriz extracelular normal. Prepare outra triplicado de 5 poços contendo apenas TFG matriz extracelular. Incubar a placa de 96 poços a 37 ° C durante 30 min. Lava-se a HUVECsuma vez com uma solução tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (PBS), e adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. Incubar a placa a 37 ° C durante 1-5 minutos, verificando as células a cada hora até que a maioria das células arredondar para cima. Desalojar as células tocando o frasco uma vez. Adicionar 5 ml de meio basal (ie, meio de crescimento de células endoteliais sem nada (por exemplo, suplementos) adicionado) com 1% de soro fetal bovino (FBS). Recolher as células no frasco através de pipetagem e transferir para um tubo de 15 ml. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Re-suspender com 2 ml de meio basal, contar as células utilizando um hemocitómetro, e ajustar a concentração de células a 2-3 x 10 5 culas / ml. Preparação de 100 ul da concentração de inibidor 10x CXCR2 SB225002 seguintes em meio basal: 11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM e 0 uM (controlo). Pipetar 300 ul da suspensão de HUVEC em cada 5 micrtubos ocentrifuge. Adicionar 33 ul de as concentrações de inibidor (11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM e 0 pM) em um tubo de cada uma contendo a HUVEC, e vortex. Pipetar 50 ul de cada uma das suspensões celulares (1-1,5 x 10 4 células) a poços individuais de matriz extracelular. Placa cada suspensão em triplicado e incubar durante 4-16 hr a 37 ° C, 5% de CO 2. Após 4-16 horas, tome 4 imagens dos tubos formados por poço usando uma câmera microscópio invertido 11 (aumento original x 100). 3. Tubule Ensaio Disruption Preparar a matriz extracelular e as placas de acordo com as mesmas especificações, como a formação do tubo de ensaio (os passos 2.1 a 2.3). Prepare suspensão de HUVEC como descrito nos Passos 2.4- 2.4.2 Formação do tubo de ensaio e alíquota numa placa de 96 poços contendo a matriz extracelular, a 50 uL por poço. Nota: Placa suficientes poços sO que há 3 poços por tratamento de droga. Cultivar células em matriz extracelular durante 4 h a 37 ° C, 5% de CO 2. Tire fotos antes do início do tratamento medicamentoso. Prepare concentrações 2x da SB225002 inibidor CXCR2 conforme descrito no Passo 2.5 do ensaio de formação do tubo, e adicionar 50 uL de cada concentração por poço da placa de 96 poços contendo a HUVEC. Placa cada concentração em triplicado. Incubar a placa durante mais 2-12 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Tomar 4 imagens dos tubos formados em cada poço usando um microscópio invertido câmara (ampliação original x 100) 11. 4. Dados Quantificação Avaliar a formação de tubo capturado nas imagens, medindo o comprimento total do tubo de tubos em quatro campos aleatórios utilizando o software da câmara microscópio. Abra a imagem no software da câmera microscópio, e clique em "Anotações e Medições9 ;. Na seção 'tamanho', selecione a ferramenta "linha simples". Clique na imagem, em seguida, desenhar uma linha ao longo do comprimento do tubo, em seguida, clique direito. Nota: O software calcula automaticamente o comprimento da linha em pixels e colocar os dados em um arquivo. Repita o procedimento para todas as linhas de metro na imagem, selecionando a ferramenta "linha simples". Clique na imagem, em seguida, desenhar uma linha ao longo do comprimento do tubo, em seguida, clique direito. Nota: O software gravar o comprimento de cada linha e exibir os dados no ecrã. Depois de medir cada tubo na foto, clique em "Export", em seguida, escolheu 'Comprimento de planilha'. Nota: Os dados de comprimento serão exportados para uma planilha. Adicione todos os comprimentos de tubo a partir da folha de cálculo para obter o comprimento total do tubo. Calcular e registrar o comprimento médio dos tubos. Nota: Quatro repetições são recomendados com média e desvio padrão determinado. 5. recuperação das células da Matriz Extracelular Cultura Cultura e realizar um ensaio de formação de tubo (ver secção 2) numa escala maior como uma placa de 96 poços não irá produzir a contagem de células suficiente. Para placas de 12 poços, 500 ul de usar matriz extracelular e 500 ul da suspensão de células HUVEC (5 1,5×10 células). Incubar as células durante 4-16 horas de modo a formar tubos. Em seguida, aspirar o meio de cultura celular. Lavar as células com 1 ml de frio 1x PBS sem cálcio e magnésio. Adicionar 1 ml de PBS frio-2,5-tampão de EDTA mM de gelo sobre a cultura e manter em gelo durante 10 min. Desalojar as células e mistura de matriz extracelular do prato usando uma ponteira 1.000 l com a ponta cortada, e depois transferir para um resfriado tubo de 15 ml, lavar bem com 4 ml de PBS gelado-2.5 ​​EDTA mM e colocar no tubo . Colocar os tubos em gelo durante 1-4 horas e inverter o tubo várias vezes até que todo o extracelularmatriz é dissolvido. Centrifugar durante 10 minutos a 1620 xg à temperatura de 0 ° C Re-suspender as pelotas de células com PBS frio 1 ml para um tubo de 1.ml em gelo. Centrifugar novamente durante 5 min a 3000 xg à temperatura de 0 ° C, em seguida, descartar o sobrenadante. Armazenar as células em -80 ° C.

Representative Results

formação do tubo considerável, saudável endotelial pode ser facilmente contrastadas para a formação do tubo inibida nas imagens de microscopia. Formação do tubo saudável aparece como uma teia organizada das estruturas do tipo capilar (Figura 1). Em comparação, a formação do tubo inibida manifesta-se como células dispersas (Figura 2). Tubo de ensaio de formao de dados é quantificada medindo o comprimento total do tubo de tubos capilares (Tabela 1). Além disso o comprimento total do tubo, o comprimento médio do tubo, o número total de tubos, ou o número total de pontos de ramificação pode ser medido. formação do tubo estruturado produz uma maior comprimento do tubo de líquido do que o crescimento do tubo inibido dispersos. Na Figura 3, uma curva de resposta à dose permite o cálculo da IC 50 sob as condições experimentais de células HUVEC na matriz extracelular de GFR e um inibidor de CXCR2 SB225002. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"> Figura 1. endotelial formação t Ube na matriz extracelular e crescimento (GFR) matriz extracelular reduzida-fator. Duas imagens mostram a formação do tubo de sucesso na matriz extracelular (A) e GFR matriz extracelular (B). A rede interligada de tubos mostra claramente que o crescimento dos tubos é saudável nestas células HUVEC. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. A inibição da formação do tubo em extracelular e crescimento reduzido fatores (TFG) da matriz extracelular por um SB225002 inibidor CXCR2 (5,6 mM). Duas imagens mostram tuboformação que foi inibida por um inibidor de SB225002 CXCR2 (5,6 ^ M) na matriz extracelular (A) e GFR matriz extracelular (B). Os aglomerados isolados de células HUVEC visto nesta imagem mostra que as células não foram capazes de formar os tubos necessários para conectar uns aos outros. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. curva de resposta à dose sobre o crescimento (GFR) matriz extracelular reduzida do factor. O eixo dos X mostra o comprimento do tubo e o eixo Y mostra a concentração de um inibidor de CXCR2. A curva de resposta à dose que mostra a resposta de HUVEC ao inibidor em GFR CXCR2 matriz extracelular é dependente da dose. A (inibidor máximo metade IC50Y concentração) foi calculada usando o software 13 e pode ser comparado com uma curva de resposta à dose para a matriz extracelular, por exemplo. IC50 é a concentração do inibidor que reduz a resposta a 50%. As barras de erro representam o desvio padrão. Fator de Crescimento reduzida (TFG) da matriz extracelular e inibidor (4 repetições cada) Total de tubo comprimento médio (pixels) (1 pixel = 0,34 mm) Desvio padrão P Valor controle de matriz extracelular GFR 2447 168,174 GFR extracelular SB225002 matriz + 0,56 mM 1422,5 185.4218 0.000395 TFG extracelular SB225002 matriz + 1,1 uM 1004 126.1784 2,14 x 10 -5 TFG extracelular SB225002 matriz + 5,6 uM 519,25 129.6368 4,19 x 10 -6 TFG extracelular SB225002 matriz + 11 uM 393.75 212.6857 1,21 x 10 -5 Tabela 1. Quantificação comprimentos totais do tubo sobre o crescimento (GFR) matriz extracelular reduzida-fator sob várias condições. Uma porção de uma tabela usando comprimentos totais do tubo gravadas em amostras crescidas na matriz extracelular de GFR com concentrações variáveis ​​de inibidor de CXCR2. Os dados indicam que o inibidor de CXCR2 inibe a formação do tubo. Incluem-se os valores associados, tais como média de quatro repetições, desvio padrão e valor P. Medido em pixels para mostrarOs dados que são exportados. CI 50 podem ser calculados usando software estatístico 13. (1 pixel = 0,34 uM)

Discussion

Ao realizar este ensaio, é essencial para manter a matriz extracelular em gelo ou a 4 ° C em todos os momentos, a menos que especificado de outra forma. Se a matriz extracelular é deixada aquecer acima de 4 ° C, ele irá polimerizar, e o ensaio será arruinado. É também importante assegurar que qualquer coisa que vem em contacto (por exemplo, pontas de pipeta, a placa), com a matriz extracelular é pré-arrefecida para a razão acima mencionada. O número de células semeadas em cada poço é crítica, muito poucas células não vai dar a teia esperado na amostra de controlo, muitas células irá formar grandes aglomerados de células ou uma monocamada e o ensaio não será válido. Outro factor importante para o sucesso deste ensaio é o número de passagens de células da HUVEC. O número de passagens deve ser sempre menor do que dez, caso contrário, a formação do tubo robusto pode não ocorrer. Além disso, deve-se assegurar que o meio de cultura celular a ser usado não expirou, ou as células não será viável. alternattivamente, pode-se alíquota do meio e dos seus componentes e armazená-las a -20 ° C para preservar, por um período de tempo após a data de validade. É claro, é ainda preferível utilizar a forma anterior à data de expiração

Como todos os procedimentos, existem algumas desvantagens para a realização do ensaio de formao de tubo endotelial celular. Um problema importante é que, porque existem diferentes tipos de células endoteliais e matrizes de suporte, os resultados do ensaio podem variar muito dependendo de qual é utilizado o tipo de célula e matriz. As células endoteliais usadas (HUVECs, HAECs ou HMVECs) são células primárias, que são dispendiosos e têm de obter a variabilidade em relação a células imortalizadas. As células primárias têm passagens limitadas para utilização, e, por conseguinte, não são adequados para as experiências de angiogénese de longa duração 14. Para dados fiáveis, deve-se sempre usar os mesmos tipos para o ensaio. Tal como com outros ensaios in vitro, os resultados de um ensaio de formação de tubo deve ser confirmado in vivo, porque os resultados das condições controladas e artificiais de cultura de tecidos de duas dimensões não podem sempre ser reflectida na Biosystem complexo de um organismo vivo. É também importante ter em mente que este tipo de ensaio só pode ser utilizado para demonstrar a formação de tubos de células endoteliais, e não deve ser usada para testar outros, não endotelial, células tubo de formação.

Este ensaio é um método bastante simples e rápido para quantificar o potencial angiogénico de um composto. Também constitui uma plataforma para outras experiências, como por si só, não fornecem informação a respeito do mecanismo específico pelo qual o composto atinge efectivamente o processo de formação de vasos. No entanto, a utilização de matrizes extracelulares variadas é um exemplo de como criar ainda uma estrutura para questões de investigação que não é vulgarmente utilizado. Existem abordagens para estudar os mecanismos de bio-químicas específicas do composto, incluindo os inibidores específicos de componentes que têm como alvoa via de angiogénese. Outra abordagem pode ser para extrair ARN a partir das células endoteliais e utilizar RT-PCR (PCR em tempo real) 12 analisar as alterações da expressão do gene que podem causar o comportamento de crescimento observada no ensaio. As aplicações futuras deste método incluem transfectadas HUVECs para criar knock-down ensaios para passos específicos da via da angiogénese. Existe potencial para aplicar esta abordagem para o estudo da via linfangiogénese. Ao alterar os componentes da matriz extracelular, a interacção da matriz e o processo celular de apoio angiogénese no cancro podem ser mais elucidado. A extração de RNA e proteínas a partir de células endoteliais sob estas condições específicas fornecer dados quantificáveis ​​adicional correspondente à imagem latente de dados.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.

Materials

EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) Fisher NC9525043 HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin.  Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm  in 37 oC  before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free Fisher CB-40230  Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in   -20 oC , warm in 4 °C  before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free Fisher CB-40234  extracellular matrix, keep in   -20 oC, warm in 4 °C  before use.
SB225002 Fisher 559405 CXCR2 inhibitor, keep in   -20 oC, warm in room temperature  before use.
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)  ScienCell Research Laboratories  8000 culture it according reference  10.
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red Invitrogen 25300-054 keep in 4 oC, warm  in 37 oC  before use.
Nikon ECLIPSE Ti Nikon Inverted Research Microscope. 
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit Nikon Inverted Research Microscope software
Graph-pad Prism 5 GraphPad Software, Inc. scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50.
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References

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Xie, D., Ju, D., Speyer, C., Gorski, D., Kosir, M. A. Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (114), e54074, doi:10.3791/54074 (2016).
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