Эффективная и высокая Метод Выход для выделения мышиных дендритных клеток подмножествах

Дендритные клетки (ДК) были обнаружены почти сорок лет назад как "большой звездчатые (греческий дендрон) клетка" находится в лимфоидных органах ^1. Многие исследования показали , что контроллеры домена являются единственными антиген – представляющих клеток , которые могут эффективно стимулировать наивные Т – клетки ^2. Основная функция этих клеток является поглощение и презентацию антигенов и их эффективную обработку и загрузку их на антиген-представляющих молекул. В селезенке мыши, контроллеры домена могут быть разделены на плазмоцитов и обычных подмножеств. В плазмоцитов ДК характеризуются низкой экспрессии CD11c и высоких уровней B220 и Gr-1. Они также являются позитивными для поверхностного маркера mPDCA1 и секретируют типа интерферона в ответ на Толл-подобные рецепторы 9 (TLR9) лигандов. Обычные контроллеры домена являются высокими для CD11c и экспрессии МНС класса II. Они могут быть разделены на три отдельные подмножества на основе поверхностной экспрессии фенотипических маркеров, таких как CD4, CD8α, DEC205, компакт-диск11b и дендритных клеток ингибирующий рецептор 2 (DCIR2, распознается антителом 33D1) белки ^3,4. В CD8α ^Pos контроллеры домена также известны как cDC1, являются позитивными для DEC205, но отрицательный результат для миелоидных маркеров , таких как CD11b и 33D1. CD8α ^отр контроллеры домена, называемый также Cdc2, являются положительными для 33D1, CD11b и CD4 , но не имеют DEC205. Двойное отрицание подмножество (т.е. отрицательный как для CD4 и CD8α) относительно редко, и является негативной для DEC205 и 33D1. Это наименее отличающееся подмножество и может быть менее дифференцированными форма CD8α ^Neg DC.

Фенотипические различия в различных подмножеств DC также распространяются на их функции в естественных условиях. CD8α ^отр контроллеры домена обладают высокой фагоцитарной и , как полагают , чтобы представить экзогенный антиген в основном через МНС класса II к CD4 Т – клеток ^3. В противоположность этому , CD8α ^Pos контроллеры домена специализированы для представления растворимого белкового антигена на MHC класса Iв механизме называется кросс-презентации. Результаты перекрестной презентации зависит от состояния активации этих контроллеров домена ^5, и может привести либо к расширению цитотоксических Т – клеток (CTL) или развитие регуляторных Т – клеток , ^{6 2,7.} Нацеливание антигена CD8α ^Pos ГЦ с использованием анти-DEC205-антителоопосредуемый результатами доставки в основном к удалению Т – клеток , ^8, в то время как презентация антигенов , полученных из инфицированных апоптотических клеток индуцирует сильный CTL – ответ ^9.

В дополнение к признанию пептидных антигенов, иммунной системы млекопитающих эволюционировала распознавать липидный и гликолипидов антигены. Эти антигены представлены молекулами CD1, которые являются MHC класса I, как белки клеточной поверхности, которые существуют в нескольких связанных форм в различных млекопитающих. У мышей, один тип высококонсервативной молекулы CD1 называется CD1d отвечает за представление гликолипида антигенов ^10. Основным популяция Т-клеток, которые распознают CD1d / гликолипидов комплексы называют инвариантными клетки НКТ (iNKT клетки). Эти клетки экспрессируют полуинвариантом Т – клеточного рецептора (TCR) , состоящий из инвариантной TCRα цепи, которая в паре с TCR & beta ; цепи , которые имеют ограниченное разнообразие ^11. В отличие от обычных Т – клеток , которые должны размножаться и дифференцироваться , чтобы стать активированные эффекторные Т – клетки, клетки iNKT существуют как эффекторной популяции и начинают быстро отвечать на запросы после введения гликолипидов ^12. Идентификация физиологически соответствующих липидный антигенпрезентирующих клеток является активной областью исследований, а также несколько различных типов клеток, таких как В-клетки, макрофаги и ДК было предложено выполнить эту функцию. Тем не менее, было показано , что CD8α ^Pos подмножество ГЦ является первичной ячейкой опосредовать поглощение и представление липидных антигенов мыши iNKT клетки ¹³ и гликолипидов опосредованного перекрестного примирования CD8 Т – клеток ^14.

ove_content "> Для сравнения эффективности презентации антигена с помощью различных антиген-представляющих клеток, простой подход состоит в передаче различных типов очищенных АРС импульсными с эквивалентными количествами антигена в наивных хозяев. Эксперименты клеточного переноса этого типа часто выполняются для иммунологических исследований. Тем не менее, проведение исследований переноса с экс виво антиген обработанного ГЦ является сложной задачей, так как эти клетки существуют как редкие популяции в лимфоидных органах , где они составляют менее 2% от общего количества клеток ^15. поэтому необходимо усилить развитие этих клеток в животных – доноров для повышения эффективности протоколов изоляции.

Известно , что общий лимфоидной и миелоидной общие клетки – предшественники, которые необходимы для генерации Pdc, CD8 и ^Pos подмножеств CD8 ^отр DC, экспресс – FMS связанных с рецепторной тирозинкиназы 3 (Flt-3). При в естественных условиях Flt-3 лиганд (Flt-3L) введение, emigratион Flt-3 , экспрессирующих клеток – предшественников костного мозга увеличивается, что приводит к увеличению обсеменения периферических лимфоидных органах и расширение их зрелого потомстве DC ^16. Выражение FLT-3 теряется во время приверженности B, T или NK путей дифференцировки клеток. Таким образом, лишь минимальные изменения наблюдаются в этих клетках при введении Flt-3L. Подобное расширение в популяциях постоянного тока наблюдается у мышей , несущих опухоли путем имплантации клеточной линии В16-меланома , секретирующих мышиный FLT-3L, который обеспечивает простой и экономичный способ обеспечения устойчивые системные уровни FLT-3L ^17,18. Используя этот подход, мы разработали протокол, основанный на имплантации B16-клеток меланомы, секретирующих Flt-3L, чтобы стимулировать расширение всех нормальных подмножеств DC в селезенке мышей, тем самым значительно увеличивая урожаи этих клеток, которые могут быть выделены для последующих экспериментов , Мы последовательно находим, что в течение 10 – 14 дней после подкожного внутримышечноплантация опухоли, секретирующие Flt-3, мыши развивают спленомегалия с выраженным обогащением контроллеров домена составлять 40 – 60% от общего количества клеток селезенки. Из этих селезенке, различные подмножества DC могут быть выделены с высокой степенью чистоты с использованием стандартных коммерчески доступных наборов очистки клеток, которые используют подмножество специфических фенотипических маркеров.