Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritische Zellen (DC) wurden vor fast vierzig Jahren entdeckt , als die "große stel (griechisch Dendron) Zelle" ¹ in lymphatischen Organen. Viele Studien haben gezeigt , dass DCs die einzigen Antigen – präsentierende Zellen sind , die effektiv naiver T – Zellen zu stimulieren ^2. Eine wichtige Funktion dieser Zellen ist die Aufnahme und Präsentation von Antigenen und deren effiziente Verarbeitung und Laden derselben auf Antigen-präsentierenden Molekülen. In der Milz der Maus können DCs in plasmazytoiden und konventionelle Subsets getrennt werden. Die plasmazytoiden DCs zeichnen sich durch niedrige Expression von CD11c und ein hohes Maß an B220 und Gr-1 aus. Sie sind auch positiv für die Oberflächenmarker mPDCA1 und absondern Typ I in Reaktion auf maut Interferon like Rezeptor 9 (TLR9) Liganden. Die herkömmlichen DCs sind hoch für CD11c und MHC-Klasse-II-Expression. Sie können auf der Grundlage der Oberflächenexpression von phänotypischen Markern wie CD4, CD8a, DEC205, CD in drei verschiedene Untergruppen aufgeteilt werden,11b und dendritischen Zellen hemmenden Rezeptor 2 (DCIR2, anerkannt durch den 33D1 – Antikörper) Proteine ^​​3,4. Die CD8a ^Pos DCs sind auch als CDC1 bekannt ist , sind positiv für DEC205, aber negativ für myeloische Marker wie CD11b und 33D1. Die CD8a ^Neg DCs, auch cdc2 genannt, sind positiv für 33D1, CD11b und CD4 aber es fehlt DEC205. Die doppelt negative Untergruppe (dh negativ für beide CD4 und CD8a) ist relativ selten, und ist negativ für DEC205 und 33D1. Es ist die am wenigsten charakterisierten Teilmenge und kann eine weniger differenzierte Form von CD8a ^Neg DC sein.

Phänotypischen Unterschiede in den verschiedenen Teilmengen DC auch auf ihre in vivo – Funktionen erweitern. Die CD8a ^Neg DCs sind stark phagozytierenden und werden gedacht , exogene Antigen zu präsentieren hauptsächlich über MHC – Klasse – II an CD4 – T – Zellen ^3. Im Gegensatz dazu sind die CD8a ^Pos DCs Fach zur Präsentation von löslichem Protein – Antigen auf MHC – Klasse Iin einem Mechanismus Kreuzpräsentation genannt. Das Ergebnis der Kreuzpräsentation hängt von der Aktivierungsstatus dieser DCs ^5, und kann entweder zur Expansion von zytotoxischen T – Zellen (CTL) oder die Entwicklung von regulatorischen T – Zellen ^{6 2,7} führen. Targeting von Antigen an CD8a ^Pos DCs unter Verwendung von Anti-DEC205-Antikörper-vermittelte Abgabe resultiert im Wesentlichen in der Streichung von T – Zellen ^8, während Präsentation von infizierten apoptotischen Zellen abgeleiteten Antigenen induziert eine starke CTL – Antwort ^9.

Zusätzlich zur Erkennung von Peptidantigenen, hat das Immunsystem von Säugetieren entwickelt Lipid und Glycolipid-Antigene zu erkennen. Diese Antigene werden von CD1-Molekülen präsentiert werden, welche MHC-Klasse-I-like Zelloberflächenproteine, die in mehreren verwandten Formen in verschiedenen Säugetieren existieren. Bei Mäusen, die so genannte eine einzige Art von hochkonservierten CD1 – Molekül ist CD1d verantwortlich für die Präsentation von Glycolipid – Antigenen ^10. Der Bürgermeister Population von T-Zellen, die CD1d / Glykolipid Komplexe erkennen ist invariant NKT-Zellen (iNKT Zellen) genannt. Diese Zellen exprimieren ein semi-invariant T – Zell – Rezeptor (TCR) einer invariant TCR & agr; Kette zusammengesetzt , die mit TCR & bgr; Ketten gekoppelt ist , die ¹¹ Vielfalt begrenzt haben. Im Gegensatz zu herkömmlichen T – Zellen , die aktiviert Effektor – T – Zellen zu vermehren und zu differenzieren müssen zu werden, existieren iNKT Zellen als Effektor Bevölkerung und beginnen schnell nach Glykolipid Verwaltung ¹² reagiert. Identifizierung von physiologisch relevanten präsentierenden Zellen Lipid-Antigen ist ein aktives Forschungsgebiet, und mehrere verschiedene Zelltypen, wie beispielsweise B-Zellen, Makrophagen und DCs wurden vorgeschlagen, um diese Funktion auszuführen. Es wurde jedoch gezeigt , dass die CD8a ^Pos Teilmenge von DCs die primäre Zelle ist vermittelnde Aufnahme und Präsentation von Antigenen auf Lipid Maus iNKT Zellen ¹³ und Glycolipid – vermittelten cross-Priming von CD8 – T – Zellen ^14.

ove_content "> Um die Effizienz der Antigen-Präsentation durch verschiedene Antigen-präsentierende Zellen zu vergleichen, ein einfacher Ansatz ist, verschiedene Arten von gereinigten APCs gepulst mit äquivalenten Mengen an Antigen in naiven hosts. Cell Transfer Experimente dieses Typs übertragen werden häufig für immunologische Untersuchungen durchgeführt. Allerdings Durchführen eines Transferstudien mit ex vivo Antigen behandelt DCs ist eine Herausforderung, da diese Zellen so selten Populationen in lymphatischen Organen bestehen , wo sie machen weniger als 2% der gesamten Zellen ^15. daher ist es notwendig , die Entwicklung dieser Zellen in Spendertiere zu verbessern die Effizienz der Isolation Protokolle zu erhöhen.

Es ist bekannt , dass die gemeinsame lymphoiden und myeloiden Vorläufern gemeinsamen, die zur Erzeugung von pDC, CD8 ^Pos und CD8 ^Neg DC Subsets express fms-verwandte Rezeptor – Tyrosinkinase 3 (Flt-3) erforderlich sind. Bei der In – vivo – Flt-3 – Ligand (Flt-3L) Verwaltung, emigratIon von Flt-3 – Vorläuferzellen aus dem Knochenmark exprimiert , wird erhöht, ¹⁶ in der erhöhten Aussaat von peripheren lymphatischen Organen und den Ausbau ihrer reifen DC Nachkommen zur Folge hat . Die Expression von Flt-3 wird während der Verpflichtung zur B, T oder NK-Zell-Differenzierungswege verloren. Daher ist nur eine minimale Veränderungen in diesen Zellen auf Flt-3L Verabreichung beobachtet. Ähnliche Expansion in DC – Populationen in Mäusen beobachtet tragenden Tumoren , die durch Implantation eines B16-Melanomzelllinie sekretierenden murinen Flt-3L, die für die Bereitstellung anhalt systemische Spiegel von Flt-3L ^17,18 , ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur Verfügung stellt. Unter Verwendung dieses Ansatzes haben wir ein Protokoll basiert auf der Implantation von B16-Melanomzellen sezer Flt-3L entwickelt, um die Expansion aller normalen DC Untergruppen in der Milz der Maus zu stimulieren und somit erheblich die Ausbeuten dieser Zellen zu erhöhen, die für die nachfolgenden Experimenten isoliert werden kann . Wir finden immer wieder, dass innerhalb von 10 bis 14 Tagen nach subkutaner imPlantage des Tumors Flt-3 sezernierenden, Mäuse entwickeln Splenomegalie mit deutlichen Anreicherung von DCs 40 zu bilden – 60% der gesamten Milz-Zellen. Aus diesen Milzen können verschiedene DC Untergruppen mit hoher Reinheit unter Verwendung von handelsüblichen Zellreinigung Kits isoliert werden, die Teilmenge spezifischen phänotypischen Marker verwenden.