Eşzamanlı İki foton<em> İn Vivo</em> Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler
Summary
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Abstract
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Introduction
İki foton mikroskopi yaşayan ve hayvanları davrandığını beyin aktivitesinin gözlem devrim. 1990 yılında piyasaya sunulmasından bu yana hızla popülerlik kazanmıştır ve şimdi in vivo 1,2 beyin aktivitesinin birçok yönleriyle incelenmesi yönünde en ilginç ve yenilikçi yaklaşımlarından biri olarak uygulanır. Bu uygulamalar ve nöronal hücrelerin morfolojisi (kalsiyum seviyesi göstergeleri veya erken genler ifade kullanarak, örneğin) kan akım ölçümleri, nöronal aktivasyon dahildir. Laboratuvarların sayısı giderek artıyor in vivo beyin görüntüleme için yeni bir standart olarak bilimsel dünyada tekniği uygulayan, iki foton mikroskopları kullanın.
Standart yaklaşım kafatası pencere implantasyon varil ya da fare beyninin 3 görsel korteks üzerinde (bir kapak camı ile kapatılmış kafatasına bir yuvarlak delik) içerir. Daha sonra, deney protokolüne göre, MMse zaman 4,5 üzerinde beyin aktivitesi ve nöronal morfoloji değişiklikleri izlemek için izin, görselleştirme ve davranışsal eğitim oturumları bir dizi uğrar. Her iki durumda da kraniyotomi sadece sütürler geçmeden, parietal kemik etkiler. Büyük ölçüde tekniğin başlıca dezavantajı, bu tür hazne ya da görsel korteksin kolayca erişilebilir korteks için sınırlı bir uygulama olduğuna inanılmaktadır. diğer bölgelere göre kraniyal pencere implantasyonu nedeniyle aşırı kanama ve / veya uzaysal engel için, zorluklar bir çok oluşturmaktadır.
Bu yazıda in vivo mikroskopi 6 iki-foton ilgi başka bir olası bölge olarak retrosplenial korteks (RSC) Yukarıdaki kraniyal pencere implantasyonu öneriyoruz. RSC uzaysal oluşumundan sorumlu beyin devresinin önemli bir unsurdur. Anatomik, RSC kortikal, hipokampal ve talamik bölgeleri 7 bağlayan bir nöronal ağın bir parçasıdır. Buağır gibi uzamsal öğrenme ve nesli yanı sıra mekansal navigasyon 6 gibi davranışların, bir dizi çıkıyor.
Nöronların morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için biz Thy1 promoteri altında yeşil floresan protein (GFP) eksprese eden bir transgenik fare hattı kullanır. Bu farelerde, GFP iki foton mikroskopi 8 kullanarak kortikal akson ve dendritler net görüntülenmesi için izin beyindeki nöronların yaklaşık% 10 olarak ifade edilir. Biz teklif Başka bir yenilik RSC projelendirme beynin derin yapılara bir nöron spesifik CaMKII promotör 9 altında kırmızı floresan proteini (mCherry) kodlama bir rekombinant adeno-ilişkili virüs serotipi 2/1 (/ 1 RAAV2) enjekte edilmesidir hipokamp gibi. Thy1-GFP fare hipokampusunda rAAV2 / 1 mCherry sentezleme Hippocampo-cortica öncesi ve postsinaptik elemanlarının aynı anda görüntülenmesi sağlarl 10 sinapsların. Protein aksonal terminallerde yeterli düzeyde ulaşmasını mCherry rAAV güdümlü ifade iki ila üç hafta gerektirir. Bu süre Kraniotomi kurtarma için gerekli her zamanki saatinde ile tutarlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geçerli yazıda kranial pencereden RSC sinaptik giriş ve postsinaptik hedeflerin in vivo görüntüleme eş zamanlı iki foton için bir protokol mevcut. implantasyon prosedürü birkaç anahtar aşamadan oluşmaktadır. İlk olarak, hayvan derin anestezi ve stereotaktik çerçeve sabittir, daha sonra RSC üzerinde kafatası belirgin bir dairesel çizgiler boyunca matkap ve dairesel kemik kaldırılır ile inceltilir. Kanama durdurulduktan sonra, RAAV2 / 1 MCherry hipokampus enjekte edilir ve kapak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar filme yardım için ses kayıtları, çizimler M. Borczyk, virüs üretimi A. Trąbczyńska, genotipleme M. Ziókowska ve A. Mirgos M. Steczkowski teşekkür etmek istiyorum. KR K. Deisseroth gelen CAMK promoterinin kontrolü altında floresan protein mCherry rekombinant adeno-ilişkili virüs (AAV) tür hediye kabul eder. Bu proje Avrupa Birliği tarafından finanse edilen CEPT altyapısı kullanılarak, Doku Yapısı ve İşlevi, Nörobiyoloji, Deneysel Biyoloji Nencki Enstitüsü Merkezi'nin Hayvan Modelleri ve Laboratuvar Laboratuvarı çekirdek tesislerinde gerçekleştirildi – Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu içinde 2007-2013 Operasyonel Programı "Yenilikçi Ekonomi". Bu çalışma, Ulusal Bilim Merkezi'ne hibe ile desteklenmiştir: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / G / KR ve Sonata Bis 2014 NZ24 / 00691 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC
Materials
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
