שני פוטונים סימולטני<em> In vivo</em> הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial
Summary
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Abstract
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Introduction
שני הפוטונים מיקרוסקופיה מהפכת התצפית של פעילות המוח הן חי ופועל חיות. מאז השקתו בשנת 1990 הוא במהירות לפופולריות והוא מיושם כיום כאחת הגישות המעניינות והחדשניות ביותר כלפי בחינת היבטים רבים של פעילות מוח in vivo 1,2. יישומים אלה כוללים מדידות זרימת דם, הפעלת נוירונים (למשל, באמצעות אינדיקטורים רמת סידן או ביטוי גנים מוקדם מיידיים) ואת המורפולוגיה של תאים עצביים. מספר גדל והולך של מעבדות להשתמש מיקרוסקופי שני פוטונים, יישום הטכניקה ברחבי העולם המדעי כסטנדרט חדש עבור הדמיה המוחית in vivo.
הגישה הסטנדרטית כוללת השתלה של החלון גולגולתי (חור עגול הגולגולת מכוסית זכוכית לכסות) מעל החבית או בקליפת המוח הראייתית של עכבר המוח 3. לאחר מכן, בהתאם לפרוטוקול הניסוי, mouse עובר סדרה של ויזואליזציה והדרכות התנהגותי, המאפשר לעקוב אחר השינויים בפעילות המוח והמורפולוגיה עצבית לאורך זמן 4,5. בשני המקרים craniotomy משפיע רק על עצם הקודקוד, מבלי לחצות את התפרים. הוא האמין בעיקר כי החיסרון העיקרי של השיטה הוא היישום שלה מוגבל cortexes ונגיש כגון חבית או בקליפת המוח הראייתית. השרשה של החלון גולגולתי על פני אזורים אחרים מציבה הרבה קשיים, עקב דימום יתר ו / או הפרעה מרחבית.
במאמר זה אנו מציעים את ההשתלה של החלון גולגולתי מעל הקורטקס retrosplenial (RSC) כעוד באזור ריבית אפשרי עבור שני פוטונים in vivo מיקרוסקופיה 6. RSC היא מרכיב חשוב של המעגל במוח האחראי על היווצרות הזיכרון המרחבי. אנטומית, RSC היא חלק מהרשת עצבית חיבור קליפת מוח, בהיפוקמפוס, ואזורים התלמוס 7. זהבכבדות מעורב במגוון של התנהגויות, כגון לימוד ושינון הכחדה המרחבית וכן ניווט מרחבית 6.
על מנת להמחיש את השינויים המורפולוגיים של נוירונים אנו משתמשים קו עכבר מהונדס מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת אמרגן Thy1. בעכברים אלו, GFP מתבטא כ 10% של הנוירונים במוח המאפשרים להדמיה ברורה של אקסונים קליפת המוח דנדריטים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים 8. חידוש נוסף שאנו מציעים הוא הזרקה של סרוטיפ וירוס adeno הקשורים רקומביננטי 2/1 (מרמת rAAV2 / 1) קידוד חלבון פלואורסצנטי אדום (mCherry) תחת האמרגן camkii ספציפי נוירון 9 לתוך המבנים העמוקים יותר של המוח מקרין RSC , כגון ההיפוקמפוס. הביטוי של מרמת rAAV2 / 1 mCherry בהיפוקמפוס של העכבר Thy1-GFP מאפשר להדמיה סימולטני של אלמנטים טרום postsynaptic של hippocampo-cortical הסינפסות 10. הביטוי rAAV מונחה של mCherry דורש שבועיים עד שלושה שבועות לחלבון להגיע לרמה מספקת במסופים אקסונלית. תקופה זו עולה בקנה אחד עם הזמן הרגיל הנדרש להתאוששות מן craniotomy.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר הנוכחי אנו מציגים פרוטוקול עבור שני הפוטונים סימולטני in vivo הדמיה של תשומות הסינפטי מטרות postsynaptic ב RSC דרך חלון גולגולתי. הליך ההשתלה להשתרע על פני כמה שלבים עיקריים. ראשית, החיה בהרדמה עמוקה וקבוע בפריים stereotactic, אז הגולגולת מעל RSC היא דלילה עם מקדחה בנוסח החו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות מ Steczkowski להקלטות קול, מ Borczyk עבור ציורים, א Trąbczyńska לייצור וירוס, מ Ziókowska עבור genotyping וא Mirgos לסיוע בעבודת המצלמה. KR מכיר מתנה סוג של וירוס adeno הקשורים רקומביננטי (rAAV) המבטאים חלבון פלואורסצנטי mCherry בשליטת היזם CaMK מ ק דייזרות. פרויקט זה בוצע במתקני הגרעין של מעבדה של מודלים בבעלי חיים המעבדה של מבנה רקמות ותפקוד, מרכז לנוירוביולוגיה, Nencki המכון לביולוגיה ניסויית, עם השימוש בתשתית CEPT במימון האיחוד האירופי – קרן האירופית לפיתוח אזורי בתוך התכנית התפעולית "כלכלה חדשנית" עבור 2007-2013. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של הלאומית למדע מרכז: סונטה Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02,996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00,861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00,691 ל KR וסונטה Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC
Materials
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
