Simultanée à deux photons<em> In Vivo</em> Imagerie d'entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

La microscopie à deux photons a révolutionné l'observation de l'activité cérébrale dans la vie et de se comporter animaux. Depuis son introduction en 1990 , il a rapidement gagné en popularité et est maintenant mis en œuvre comme l' une des approches les plus intéressantes et novatrices en vue de l' examen de nombreux aspects de l' activité cérébrale in vivo ^1,2. Ces applications comprennent des mesures du flux sanguin, l' activation des neurones (par exemple, en utilisant des indicateurs de niveau de calcium ou des gènes précoces immédiats expression) et la morphologie des cellules neuronales. Un nombre croissant de laboratoires utilisent des microscopes à deux photons, la mise en œuvre de la technique à travers le monde scientifique comme une nouvelle norme pour l'imagerie in vivo du cerveau.

L'approche standard consiste à l' implantation de la fenêtre crânienne (un trou rond dans le crâne recouvert d'un couvercle en verre) sur le canon ou le cortex visuel du cerveau de la souris ^3. Ensuite, selon le protocole expérimental, le MOUSE subit une série de visualisation et des séances de formation de comportement, ce qui permet de suivre l'évolution de l'activité du cerveau et de la morphologie neuronale au cours du temps ^4,5. Dans les deux cas, la craniotomie affecte uniquement l'os pariétal, sans traverser les sutures. Il est notoire que le principal inconvénient de cette technique est limitée à son application cortexes facilement accessible tel que le canon ou le cortex visuel. Implantation de la fenêtre crânienne par rapport aux autres régions pose beaucoup de difficultés, en raison de saignements excessifs et / ou entrave spatiale.

Dans cet article , nous proposons l'implantation de la fenêtre crânienne au- dessus du cortex rétrosplénial (RSC) comme une autre région d'intérêt possible pour les deux photons en microscopie in vivo ^6. RSC est un élément important du circuit responsable de la formation de la mémoire spatiale du cerveau. Anatomiquement, RSC est une partie d'un réseau neuronal de connexion corticale, hippocampique et régions thalamiques ^7. C'estfortement impliqué dans une gamme de comportements, tels que l' apprentissage spatial et de l' extinction, ainsi que la navigation spatiale ^6.

Afin de visualiser les changements morphologiques des neurones , nous utilisons une lignée de souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le promoteur de Thy1. Chez ces souris, la GFP est exprimée dans environ 10% des neurones dans le cerveau permettant une visualisation claire des axones et des dendrites corticaux utilisant microscopie à deux photons ^8. Une autre innovation que nous proposons est l'injection d'un virus adéno-associé recombinant de sérotype 01/02 (rAAV2 / 1) codant pour une protéine fluorescente rouge (mCherry) sous une CaMKII promoteur spécifique des neurones ⁹ dans les structures plus profondes du cerveau faisant saillie vers le RSC telles que l'hippocampe. L'expression de rAAV2 / 1 ^mCherry dans l'hippocampe de souris Thy1-GFP permet la visualisation simultanée des éléments de pré- et post – synaptiques de la hippocampo-cortical synapses ^10. L'expression rAAV mécanique de mCherry nécessite deux à trois semaines pour la protéine d'atteindre un niveau suffisant dans les terminaisons axonales. Cette période est conforme à l'heure habituelle nécessaire pour la récupération de craniotomie.