Одновременная Двухфотонное<em> В Vivo</em> Визуализации синаптических входов и Постсинаптических цели в коре головного мозга мыши ретроспленальной
Summary
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Abstract
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Introduction
Двухфотонное микроскопии революцию в наблюдении активности мозга в живых и ведет себя животных. С момента своего появления в 1990 году она быстро завоевала популярность и в настоящее время осуществляется в качестве одного из наиболее интересных и инновационных подходов к рассмотрению многочисленных аспектов деятельности мозга в естественных условиях 1,2. Эти приложения включают в себя измерения кровотока, нейронную активацию (например, с использованием индикаторов уровня кальция или непосредственных ранних генов экспрессии) и морфологии нервных клеток. Все большее число лабораторий используют два фотонных микроскопов, реализующие технику на протяжении всего научного мира в качестве нового стандарта для естественных изображений мозга в.
Стандартный подход включает в себя имплантацию черепной окна (круглое отверстие в черепе , покрытом покровным стеклом) над стволом или зрительной коре головного мозга мыши 3. Далее, в зависимости от протокола эксперимента, в МОДSE претерпевает ряд визуализации и поведенческих тренировок, что позволяет отслеживать изменения в активности мозга и нервных клеток с течением времени морфологии 4,5. В обоих случаях краниотомия влияет только на теменной кости, не пересекая швы. Он в значительной степени полагают, что основным недостатком этого метода является ограниченное применение в легко доступных кор, таких как ствол или зрительной коры. Имплантация черепной окна по сравнению с другими регионами создает много трудностей, из-за чрезмерного кровотечения и / или пространственное препятствие.
В данной работе мы предлагаем имплантацию черепной окна над ретроспленальной коры (RSC) в качестве еще одной возможной области , представляющей интерес для двухфотонного в естественных условиях микроскопии 6. RSC является важным элементом схемы головного мозга, ответственных за формирование пространственной памяти. Анатомически, RSC является частью нейронной сети , соединяющей корковых, гиппокаппальных и таламуса регионов 7. этоактивно участвует в различных поведений, таких как пространственное обучение и исчезновения, а также пространственной навигации 6.
Для того , чтобы визуализировать морфологические изменения нейронов мы используем трансгенной линии мышей , выражающую зеленый флуоресцентный белок (GFP) под промотором Thy1. У этих мышей GFP выражается в примерно 10% нейронов в головном мозге , позволяющих четкой визуализации корковых аксонов и дендритов с использованием двух-фотонной микроскопии 8. Еще одно новшество , что мы предлагаем является введение рекомбинантного адено-ассоциированный вирус серотипа 2/1 (rAAV2 / 1) , кодирующего красный флуоресцентный белок (mCherry) под нейрон конкретных CaMKII промотора 9 в более глубокие структуры головного мозга , выступающими в RSC , такие, как гиппокамп. Выражение rAAV2 / 1 mCherry в гиппокампе Thy1-GFP мыши позволяет одновременно визуализации пре- и постсинаптических элементов hippocampo-corticaл синапсы 10. Раав инициативе выражение mCherry требует от двух до трех недель для белок, чтобы достичь достаточного уровня в аксонов терминалов. Этот период соответствует обычному времени, необходимого для восстановления после краниотомии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящей работе мы приводим протокол для одновременного двухфотонного в естественных изображений синаптических входов и постсинаптических мишеней в RSC через черепной окно. Процедура имплантации состоит из нескольких основных этапов. Во-первых, животное глубоко под наркозом ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить М. Steczkowski для записи голоса, М. Borczyk для рисунков, А. Trąbczyńska для производства вируса, M. Ziókowska для генотипирования и А. Mirgos за помощью съемок. КР признает своеобразным подарком рекомбинантного адено-ассоциированный вирус (Раав), выражающая флуоресцентный белок mCherry под контролем промотора CaMK от К. Дейссерот. Этот проект был осуществлен на основных объектах лаборатории животных моделей и лаборатории тканевой структуры и функции, Центр нейробиологии, Nencki Института экспериментальной биологии, с использованием инфраструктуры СЕРТ, финансируемой Европейским Союзом – Европейский фонд регионального развития в рамках Оперативная программа «Инновационная экономика» на 2007-2013 годы. Эта работа была поддержана грантами от Национального научного центра: Соната Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 до КР и Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC
Materials
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
