Samtidig To-foton<em> I Vivo</em> Imaging av synaptiske innganger og postsynaptiske mål i Mouse Retrosplenial Cortex

To-foton mikroskopi revolusjonert observasjon av hjernens aktivitet i levende og oppfører seg dyr. Siden introduksjonen i 1990 det raskt vunnet popularitet og er nå implementert som en av de mest interessante og nyskapende tilnærminger til undersøkelse av mange aspekter av hjernens aktivitet in vivo ^1,2. Disse programmene omfatter blodstrømsmåling, neuronal aktivering (for eksempel ved hjelp av kalsium nivåindikatorer eller umiddelbare tidlige gener uttrykk) og morfologi av nerveceller. Et økende antall laboratorier bruker to-foton mikroskop, implementere teknikken i hele den vitenskapelige verden som en ny standard for in vivo avbildning av hjernen.

Standarden tilnærming innebærer implantering av kranie vinduet (et rundt hull i kraniet dekket med et dekkglass) over løpet eller visuelle cortex av mus hjernen ^tre. Neste, avhengig av den eksperimentelle protokollen, mouse gjennomgår en serie av visualisering og atferdsmessige kurs, slik at for å overvåke endringer i hjerneaktivitet og neuronal morfologi over tid ^4,5. I begge tilfeller kraniotomi påvirker bare isse benet, uten å krysse suturene. Det er i stor grad antas at den viktigste ulempen av teknikken er dens begrensede søknad til lett tilgjengelige cortexes eksempel fat eller visuell cortex. Implantasjon av kranie vinduet over andre områder utgjør en rekke vanskeligheter, på grunn av overdreven blødning og / eller romlig hindring.

I denne artikkelen foreslår implantasjon av den kraniale vinduet ovenfor retrosplenial cortex (RSC) som et annet mulig område av interesse for to-foton in vivo ⁶ mikroskopi. RSC er en viktig del av hjernen krets ansvarlig for romlig minne formasjon. Anatomisk, RSC er en del av en nevronale nettverk å koble cortical, hippocampus, og thalamic regioner ^7. Det ersterkt involvert i en rekke atferd, for eksempel romfølelse og utryddelse samt romlig navigasjon ^seks.

For å visualisere de morfologiske endringer av nevroner bruker vi en transgen muselinje som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under thy1 promoteren. I disse musene, er GFP uttrykt i omtrent 10% av nevronene i hjernen som muliggjør klar visualisering av kortikale aksoner og dendritter ved hjelp av to-foton mikroskopi ^8. En annen oppfinnelse som vi foreslår er injeksjon av en rekombinant adeno-assosiert virus serotype 2/1 (rAAV2 / 1) som koder et rødt fluorescerende protein (mCherry) under en neuron-spesifikk promoter CaMKII ⁹ inn i de dypere strukturer i hjernen som rager til RSC , slik som hippocampus. Ekspresjonen av rAAV2 / 1 ^mCherry i hippocampus av Thy1-GFP mus muliggjør samtidig visualisering av pre- og postsynaptisk elementer av Hippocampo-Cortiçal synapser ^10. Den rAAV-drevet ekspresjon av mCherry krever to til tre uker for proteinet for å oppnå et tilstrekkelig nivå i de aksonale terminalene. Denne perioden er i overensstemmelse med den vanlige tid som kreves for utvinning fra kraniotomi.