Summary

Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos

Published: August 20, 2015
doi:

Summary

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Abstract

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

Introduction

El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) ha revolucionado el campo de la medicina regenerativa, proporcionando un método viable para la generación de células madre específicas del paciente 1-3. hiPSCs se han generado con éxito de varios tipos de células somáticas, incluyendo fibroblastos, células hematopoyéticas 4,5 6,7, células epiteliales renales de orina 8 y queratinocitos 9,10. Hasta la fecha, los fibroblastos de piel y células hematopoyéticas representan las fuentes de células más comúnmente utilizados para la generación de CMPI específicos del paciente. Posiblemente, esto se debe al hecho de que las biopsias de piel y la extracción de sangre son procedimientos médicos de rutina y los grandes bancos de datos genéticos de la sangre o de la piel muestras de los pacientes se han establecido en muchos países.

En contraste con las células de la sangre y los fibroblastos de la piel que requieren métodos de extracción invasivos, los queratinocitos representan un tipo de célula de fácil acceso para la generación de hiPSC. KeratinocytES son células epiteliales de queratina rica que forman la barrera epidérmica exterior de la piel y también se encuentran en las uñas y el pelo 11. En particular, los queratinocitos se pueden encontrar en la vaina externa de la raíz (ORS) de los folículos pilosos, una capa celular externa que cubría el eje del pelo junto con la vaina radicular interna (IRS) células (12, Figura 1). Como colección de cabello es un procedimiento sencillo que no requiere la asistencia de personal médico, que proporciona una oportunidad para que los pacientes recogen y envían a sus propias muestras de cabello a los laboratorios, lo que facilitaría enormemente la recogida de muestras de los pacientes para la generación hiPSC. Queratinocitos epidérmicos también tienen una mayor eficiencia de reprogramación y la cinética de reprogramación más rápidas en comparación con los fibroblastos, añadiendo a las ventajas de utilizar los queratinocitos como las células de partida para la generación de hiPSC 9,13. Además, hiPSCs también se puede generar usando otras poblaciones de células dentro del folículo piloso,incluyendo las células de la papila dérmica situados en la base del folículo piloso 14,15.

Informes anteriores de la generación de IPSC utilizando células derivadas de pelo a menudo utilizan métodos de reprogramación retrovirales o basados ​​en lentivirus 9,14,15. Sin embargo, estos métodos virales introducen integración genómica indeseable de transgenes extraños durante la reprogramación. En comparación, el uso de vectores episomales representa un método de reprogramación factible, no viral para generar CMPI-integración libre 4. Hemos desarrollado previamente un método sencillo, rentable y no viral para reprogramar eficiente de queratinocitos en hiPSCs utilizando vectores episomales 13. Aquí nos proporcionan un protocolo detallado para la generación de hiPSCs de queratinocitos derivados, incluyendo la derivación de los queratinocitos de desplumado pelo, expansión y mantenimiento de los queratinocitos y la posterior reprogramación para generar hiPSCs.

Protocol

La colección de la muestra de cabello humano de las personas requiere la aprobación ética por el comité de ética de la investigación humana en las instituciones de acogida y debe hacerse de conformidad con las directrices institucionales. 1. Aislamiento de queratinocitos de pelo Plucked Descongele la matriz extracelular solución (ECM) (es decir, Matrigel) en el hielo O / N. Utilizando puntas de pipeta de pre-enfriado, añadir 200 l solución ECM de 12 ml …

Representative Results

El pelo pasa por 3 fases diferentes del ciclo de crecimiento: anágena (fase de crecimiento), catágena (la fase de regresión) y telógeno (la fase de descanso) 20,21. El folículo del pelo anagen contiene múltiples capas de epitelio; estas capas incluyen las sales de rehidratación oral, IRS y el tallo del pelo (Figura 1). Anagen pelo finalmente se somete a la transición a la fase catágena, que se caracteriza por la apoptosis de las sales de rehidratación oral y la terminación de la di…

Discussion

Generación de hiPSCs específicos del paciente ofrece un enfoque único para el estudio de la patogénesis en los tipos de células enfermas in vitro, y también proporciona una plataforma para la detección de drogas para identificar nuevas moléculas que pueden rescatar a los fenotipos de la enfermedad. Este enfoque de modelado enfermedad utilizando hiPSCs ha dado resultados prometedores para una variedad de enfermedades, incluyendo el síndrome de QT largo, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Australian Research Council Future Fellowship (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.

Materials

Antibiotic Mix: 
250 ng/ml Antimycotic amphotericin B Sigma A2942-20ml Antibiotic mix is made up in PBS. 
1X Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
PBS (-) Invitrogen 14190-144
Knockout Serum Replacement (KSR) medium:  KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use.
20% knockout serum replacement (KSR) Invitrogen 10828-028
DMEM/F12 with glutamax Invitrogen 10565-042
1× MEM non-essential amino acid Invitrogen 11140-050
 0.5× Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
 0.1 mM β-mercaptoethanol Invitrogen 21985
 bFGF (10 ng/ml, added fresh) Millipore GF003
Keratinocyte medium: 
 EpiLife with 60 µM Calcium Invitrogen M-EPI-500-CA
1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) Invitrogen S-001-5
Fetal Bovine Serum (FBS) medium:  FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE)  before use.
10% fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 26140079
DMEM  Invitrogen 11995-073
0.5× Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
2 mM L-glutamine Invitrogen 25030
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200-056
Extracellular Matrix (ECM):
Matrigel Corning  354234 Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). 
Coating Matrix Kit  Invitrogen R-011-K
Plasmids:  Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming.
-          pCXLE-eGFP Addgene 27082
-          pCXLE-hOct3/4-shP53F Addgene 27077
-          pCXLE-hSK Addgene 27078
-          pCXLE-hUL Addgene 27080
Transfection reagent Fugene HD Promega E231B
Gelatin (from porcine skin) Sigma G1890 Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. 
Reduced Serum medium: OPTI-MEM Invitrogen 31985062
Accutase Sigma A6964-100ml
Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16.
26G needle Terumo NN2613R
6-well plate (tissue culture treated) BD Biosciences 353046
12-well plate (tissue culture treated) BD Biosciences 353043
10 cm dish (tissue culture treated) BD Biosciences 353003
Dispase Invitrogen 17105-041 Use at 10mg/ml
Collagenase IV Invitrogen 17104-019 Use at 1mg/ml
TRA-160 antibody Millipore MAB4360 Use at 5µg/ml
OCT4 antibody Santa Cruz SC-5279 Use at 5µg/ml
NANOG antibody R&D Systems AF1997 Use at 10µg/ml
MycoAlert Detection kit Lonza LT07-418

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Cite This Article
Hung, S. S., Pébay, A., Wong, R. C. Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes. J. Vis. Exp. (102), e53174, doi:10.3791/53174 (2015).

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