Summary

Génération de l'intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

Published: August 20, 2015
doi:

Summary

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Abstract

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

Introduction

La découverte de cellules souches pluripotentes humaines induites (de hiPSCs) a révolutionné le domaine de la médecine régénérative, fournissant une méthode possible pour la production de cellules souches spécifiques à des patients 1-3. hiPSCs ont été générés avec succès à partir de divers types de cellules somatiques, y compris des fibroblastes, des cellules hématopoïétiques de 4,5 à 6,7, les cellules epitheliales rénales à partir de l'urine et des kératinocytes 8 9,10. À ce jour, les fibroblastes de la peau et des cellules hématopoïétiques représentent les sources de cellules les plus couramment utilisés pour générer des CSPi spécifiques au patient. Sans doute, cela est dû au fait que les biopsies de la peau et de la collecte de sang sont des procédures médicales de routine et de grandes biobanques d'échantillons de sang ou de la peau des patients ont été établis dans de nombreux pays.

Contrairement aux cellules sanguines et les fibroblastes de la peau qui exigent des méthodes d'extraction envahissantes, les kératinocytes représentent un type cellulaire facilement accessible pour la génération hiPSC. Keratinocytes sont des cellules épithéliales de kératine riche qui forment la barrière épidermique extérieure de la peau et l'on retrouve également dans les ongles et les cheveux 11. En particulier, les kératinocytes peuvent être trouvés sur la gaine externe de la racine (SRO) des follicules pileux, une couche externe cellulaire qui couvrait la tige du cheveu avec la gaine intérieure de racine (IRS) des cellules (12, figure 1). Comme la collecte de cheveux est une procédure simple qui ne nécessite pas l'assistance du personnel médical, il fournit une occasion pour les patients de recueillir et d'envoyer leurs propres échantillons de cheveux pour les laboratoires, ce qui faciliterait grandement la collecte des échantillons de patients pour la génération hiPSC. kératinocytes épidermiques ont également une efficacité de reprogrammation ultérieure et cinétique rapide de reprogrammation par rapport à des fibroblastes, en ajoutant aux avantages de l'utilisation des kératinocytes comme cellules de départ pour la production hiPSC 9,13. En outre, hiPSCs peut également être générée à l'aide d'autres populations de cellules au sein du follicule pileux,y compris les cellules de papilles dermiques situés à la base de la 14,15 du follicule pileux.

Les rapports précédents de génération iPSC utilisant des cellules de cheveux dérivé utilisent souvent des méthodes de reprogrammation rétroviraux ou à base de lentivirus 9,14,15. Cependant, ces procédés introduisent intégration génomique virale de transgènes étrangers indésirables lors de la reprogrammation. En comparaison, l'utilisation de vecteurs épisomiques représente un procédé de reprogrammation est possible, non viral pour générer iPSCs libre rapprochement 4. Nous avons déjà mis au point une méthode simple, rentable et non virale pour reprogrammer efficacement kératinocytes en hiPSCs utilisant des vecteurs épisomiques 13. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la génération de hiPSCs de kératinocytes dérivés, y compris la dérivation de kératinocytes à partir de cheveux pincées, l'expansion et le maintien des kératinocytes et la reprogrammation ultérieure de générer hiPSCs.

Protocol

La collection de l'échantillon de cheveux humains de personnes nécessite l'approbation éthique par le comité d'éthique de la recherche humaine dans les établissements d'accueil et doit être fait en conformité avec les directives institutionnelles. 1. Isolement de kératinocytes à partir de pileux épilé Thaw matrice extracellulaire (ECM) (c.-à-Matrigel) sur la glace O / N. En utilisant des pointes de pipette pré-réfrigérés, ajouter…

Representative Results

Les cheveux passe par trois phases différentes de cycle de croissance: anagène (phase de croissance), catagène (phase de régression) et télogène (phase de repos) 20,21. Le follicule pileux anagène contient de multiples couches de l'épithélium; ces couches comprennent les SRO, IRS et l'arbre des cheveux (Figure 1). Cheveux anagène finalement subit une transition à la phase catagène, qui est marquée par l'apoptose des SRO et la cessation de la différenciation de l'…

Discussion

Génération de hiPSCs spécifiques au patient offre une approche unique pour l'étude de la pathogenèse dans les types de cellules malades in vitro, et fournit également une plate-forme pour le criblage de médicaments pour identifier de nouvelles molécules qui peuvent sauver les phénotypes de la maladie. Cette approche de modélisation de la maladie en utilisant hiPSCs a donné des résultats prometteurs pour une variété de maladies, y compris le syndrome du QT long, la maladie de Huntington, la mal…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Australian Research Council Future Fellowship (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.

Materials

Antibiotic Mix: 
250 ng/ml Antimycotic amphotericin B Sigma A2942-20ml Antibiotic mix is made up in PBS. 
1X Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
PBS (-) Invitrogen 14190-144
Knockout Serum Replacement (KSR) medium:  KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use.
20% knockout serum replacement (KSR) Invitrogen 10828-028
DMEM/F12 with glutamax Invitrogen 10565-042
1× MEM non-essential amino acid Invitrogen 11140-050
 0.5× Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
 0.1 mM β-mercaptoethanol Invitrogen 21985
 bFGF (10 ng/ml, added fresh) Millipore GF003
Keratinocyte medium: 
 EpiLife with 60 µM Calcium Invitrogen M-EPI-500-CA
1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) Invitrogen S-001-5
Fetal Bovine Serum (FBS) medium:  FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE)  before use.
10% fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 26140079
DMEM  Invitrogen 11995-073
0.5× Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
2 mM L-glutamine Invitrogen 25030
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200-056
Extracellular Matrix (ECM):
Matrigel Corning  354234 Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). 
Coating Matrix Kit  Invitrogen R-011-K
Plasmids:  Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming.
-          pCXLE-eGFP Addgene 27082
-          pCXLE-hOct3/4-shP53F Addgene 27077
-          pCXLE-hSK Addgene 27078
-          pCXLE-hUL Addgene 27080
Transfection reagent Fugene HD Promega E231B
Gelatin (from porcine skin) Sigma G1890 Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. 
Reduced Serum medium: OPTI-MEM Invitrogen 31985062
Accutase Sigma A6964-100ml
Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16.
26G needle Terumo NN2613R
6-well plate (tissue culture treated) BD Biosciences 353046
12-well plate (tissue culture treated) BD Biosciences 353043
10 cm dish (tissue culture treated) BD Biosciences 353003
Dispase Invitrogen 17105-041 Use at 10mg/ml
Collagenase IV Invitrogen 17104-019 Use at 1mg/ml
TRA-160 antibody Millipore MAB4360 Use at 5µg/ml
OCT4 antibody Santa Cruz SC-5279 Use at 5µg/ml
NANOG antibody R&D Systems AF1997 Use at 10µg/ml
MycoAlert Detection kit Lonza LT07-418

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Cite This Article
Hung, S. S., Pébay, A., Wong, R. C. Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes. J. Vis. Exp. (102), e53174, doi:10.3791/53174 (2015).

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