Os canais para o transporte de moléculas de água em enzimas influenciar local solvatação e catálise activa. Aqui apresentamos um protocolo para a engenharia de estes motivos catalíticos adicionais com base em modelagem computacional silico e experimentos. Isto irá melhorar a nossa compreensão da influência da dinâmica de solventes na catálise enzimática.
Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.
A água constitui uma pedra angular para a química da vida 1. Padrões de água e solvatação de sítios ativos da enzima afetar tanto a entalpia e entropia de ligação 1,2 e catálise 3 em uma forma altamente complexa que se estende para além do efeito hidrofóbico 2,3 ligando. NMR 4, calorimetria 2 e modelagem molecular de proteínas solvatadas foram utilizados para lançar luz sobre o papel das moléculas de água explícitas no fornecimento de uma força motriz para a associação ligando 5-8, especificidade e atividade 2,9,10. Apresentamos aqui uma metodologia única para a avaliação experimental do impacto termodinâmico de deslocamento de solvente na catálise enzimática (Figura 1). Nossa estratégia combinada é baseado no uso de simulações de computador em conjunto com a engenharia de enzimas e análise termodinâmico (Figura 1). Isto permite lançar luz adicional sobre o impacto da dinâmica de solventes em catalise, que atualmente é pouco compreendida.
Estabilizando interações entálpicos, fornecidos por ligações de hidrogênio mediada por água em sítios ativos da enzima solvatado, podem ser compensados através de sanções entrópicos 1. Estes custos entrópica estão associados com a diminuição dos graus de liberdade exibida por moléculas de água confinados no interior das cavidades de proteína, em comparação com a água em grandes quantidades 5. A liberação de moléculas de água ordenados podem, assim, proporcionar uma força motriz entrópico para a associação ligando 1 e 3 catálise. Um aspecto chave da dinâmica de solventes é o deslocamento de moléculas de água entre o interior das proteínas e o solvente exterior 4. As mudanças que a acompanham em energia de ativação, entalpia e entropia 11 não são completamente compreendidos no nível molecular. Ao obstruir túneis individuais responsáveis pelo transporte de água em enzimas, a importância da dinâmica de solventes e a sua contribuição para a activaçãoa energia pode ser avaliada (Figura 1). Além disso, através da realização de um pote ensaios cinéticos a diferentes temperaturas, os parâmetros de activação termodinâmicas relativas dos vários substratos pode ser extraído a partir de um reduzido número de experiências (Figura 1, direita). Nosso método interdisciplinar é validado por enzimas triterpene ciclase complexos ligados à membrana que geram terpenos policíclicos de elevada importância para a vida 12. O protocolo permite a recuperação de grandes quantidades de proteína da membrana (10-20 mg / L), utilizando um padrão do centrifugador.
Embora enzimas evoluiu em água, o papel do solvente para a promoção da catálise é geralmente negligenciada. Além de dinâmica de proteínas 13,14 que forma pré-organizados sites ativos com complementaridade eletrostática para o estado de transição 15, dinâmica da água poderia ser de grande importância para a catálise enzimática eficiente. Forjando várias técnicas interdisciplinares, a nossaobjectivo é facilitar o estudo altamente complexo de dinâmica da água e termodinâmica. Fazendo essas ferramentas mais acessível à comunidade científica vai levar ao desenvolvimento de novas estratégias em engenharia e design enzima proteína para actividades alterados e especificidades.
Os passos mais críticos em conseguir dados experimentais termodinâmicos de alta qualidade para o tipo selvagem de enzimas membrana e túnel variantes são: 1) geração do modelo de computador; 2) as proteínas purificadas de forma homogénea; 3) os estoques de substrato emulsificados; 4) controle de temperatura durante a cinética; 5) extracção de misturas reaccionais utilizando um padrão interno.
A geração do modelo de computador é muito facilitada pelo uso de um software com uma interface fácil de usar que suporta uma variedade de plataformas. Assim, este protocolo tem como premissa a suíte de modelagem YASARA 16 para tornar a nossa estratégia acessível, mesmo para modelar os não-especialistas. Um modelo de computador para identificação túnel de água devem, idealmente, ser baseada numa estrutura de cristal da enzima de interesse 24. Para este efeito, a grande variedade de estruturas cristalinas disponíveis no banco de dados de proteínas é muito benéfico. Em nossa experiência, um aspecto fundamental na preparação bem sucedida de TEMplacas de identificação túnel é manter águas cristalográficas. É de igual importância para usar uma caixa de enzima solvatado ao realizar simulações de dinâmica molecular, que podem ser executados em um computador normal. O ciclase triterpene de Alicyclobacillus acidocaldarius é estável em água durante as simulações MD 3. No entanto, mantendo detergentes cristalográficos e / ou da membrana celular usando imita seria, talvez, ser necessária para enzimas potencialmente instáveis para permitir a simulação MD prolongados. Prevê-se que a estrutura de cristal minimizado de alvos altamente exigentes poderia proporcionar importante visão mecanicista utilizando o protocolo, embora isto não capturar aspectos dinâmicos de organização do túnel.
CAVER 19 no modo básico, com um único ou um número limitado de instantâneos como entrada, podem ser usados por não-especialistas em um laptop padrão. Com base na nossa experiência 3, túneis com um raio de gargalo (ou seja, o raiono ponto mais estreito) menor do que 1 a pode ser altamente relevante para a água, especialmente se as moléculas de água cristalográficas residem dentro do túnel previsto (Figura 1, centro-esquerda). Por outro lado, um maior raio de gargalo poderia implicar um túnel para o transporte do substrato dentro e para fora do local activo 10. O script no Código Complementar 2 do arquivo pode ser usado por não-especialistas para a visualização dos túneis previstos. Experiências futuras irá revelar se modelos de homologia serão de resolução suficientemente alta para permitir o estudo atomizado de redes de água e dinâmicas. Lançando luz sobre como realizar simulações de dinâmica molecular, com e sem um ligando presente no sítio ativo, influencia o processo de identificação do túnel também seria de importância.
Cinética de proteínas de membrana pode constituir um desafio formidável 25. O protocolo aqui baseia-se num protocolo de extracção simples de membranapara se obter a enzima da membrana, sem o uso de equipamento caro, tal como uma ultracentrífuga. A utilização de filtração em gel como um passo final de polimento remove partículas potenciais de membrana residual e permite a definição de um ambiente de detergente adequado 25.
Um aspecto essencial na obtenção de resultados reprodutíveis cinéticos a partir do protocolo é a de emulsionar a solução stock de substrato por meio de ultra-sons. Vórtex simples de substratos hidrofóbicos diluídos no tampão de reacção dá-substrato misturas de detergentes não homogéneos. A pipetagem das soluções de substrato não-emulsionados leva a concentrações irreproduzíveis (confirmada por GC quantitativa), que impede a determinação exata das taxas iniciais. Em contraste, a pipetagem das soluções de reserva apropriadamente emulsionadas deve resultar em análise de regressão linear das taxas iniciais com R 2 na gama de 0,98-0,99. Outro aspecto importante de substratos hidrófobos é o substrato solubilidade aparentee disponibilidade nas misturas substrato detergentes. De facto, não foi possível saturar a ciclase de esqualeno triterpeno com o substrato de referência. Por esta razão aparente k cat / K M valores são aqui apresentados, que poderia conter contribuições de ambos vinculativos e química. No entanto, demonstrou-se que a química é limitadora da velocidade para k cat / K M para a cascata polycyclization conduzida por adenilato triterpenos 3.
É de grande importância para verificar a temperatura real dentro de um frasco de vidro de reacção com um termómetro externo. Ainda assim, ajustes lineares podem ser mais pobres para as variantes com constantes essencial aparente k cat / K M valores em diferentes temperaturas. Esta é forçada para a variante S168F aqui (Figura 2A) com uma entalpia de activação próximo de zero (Figura 2B e 2C). Muito small mudanças de temperatura-dependentes em aparente k cat / K M, poderia induzir a incerteza na entropia activação observada Δ ‡ S (ou seja, a intercepção nas parcelas lineares na Figura 2B). Em princípio, a entropia de activação observado também pode ser afectada por uma abundância de enzimas activas diferentes para diferentes variantes, as quais não seriam detectados medindo a concentração de proteína. Espera-se que os erros experimentais são reduzidas quando a mistura de vários substratos em uma panela. Isto porque todos os diferentes substratos de interagir com a mesma quantidade de enzima nestas circunstâncias (equação 4). A utilização de um solvente de extracção enriquecida com um padrão interno é importante para ter em conta diferenças durante a extracção e / ou GC-injecção.
Teoria do estado de transição tem sido usado com sucesso em 26 de enzimologia. Este quadro teórico importante foi originalmente desvolvido para unimoleculares reacções em fase gasosa. No entanto, tem sido demonstrado que as enzimas funcionam principalmente através da redução da barreira de energia de activação 26 clássica. O coeficiente de transmissão assumido como sendo um aqui poderia afectar a entalpia de activação medidos e / ou entropia. A contribuição de encapsulamento, e outros efeitos não-clássicos tais como recruzando do estado de transição, pode contribuir aproximadamente 1000 vezes a catálise 26 correspondente a aproximadamente 4 kcal / mol em energia. Pode ser visto que a entropia de activação exibida pela enzima de tipo selvagem (16 kcal / mol a 328 K, Figura 2C) é muito maior do que tais efeitos não clássicos causadas por um coeficiente de transmissão não-uniforme. A incidência do coeficiente de transmissão deve diminuir ao comparar parâmetros termodinâmicos de ativação para o tipo de túnel e as variantes selvagens usando o protocolo.
O Gibbs energia livre de ativação (‡ Δ G) é composed de ambos um entálpica (Δ H ‡) e um entrópica (- T * Δ S ‡) prazo. Reorganização solvente em enzimas durante a catálise pode influenciar ambos os parâmetros. Se espera que o presente protocolo para facilitar o estudo desses fenômenos reunindo uma caixa de ferramentas de ferramentas computacionais relevantes e de fácil utilização in silico com o quadro experimental biofísica necessário. Prevê-se que o método seja útil para o estudo de uma grande variedade de processos enzimáticos, incluindo catálise por enzimas ligadas a membranas.
The authors have nothing to disclose.
The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.
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