揭开熵率的加速溶剂动力学的膜酶诱导

1.在硅片计算机模拟从蛋白质数据库（PDB）中下载的目的蛋白质的一个PDB结构。通过除去过量的亚单位，然后添加缺少的氢原子和明确的溶剂中，使用了“细胞中和和p K A预测”的实验中YASARA 16制备的结构。为膜结合的三萜环化酶，水箱的合适的尺寸是91x67x77埃。手动调整的催化活性的氨基酸的质子化状态。 注意：如果需要，在PDB文件基质类似物可以通过使用“编辑|交换|原子”进行修改，以一个真正衬底命令。 通过使用AMBER力场套件17的“能量最小化”命令最小化的结构。使用粒子网埃瓦尔德方法（PME）18考虑到长程静电相互作用。将截止于范德华相互作用根据标准设置。 注：“能量最小化”命令，通过短陡下降最小化，然后模拟退火消除构应力（时间步长2 FSEC，0.9每10 个步骤缩减原子的速度）进行，直至达到收敛（ 即提高能源小于0.012千卡/每原子在200步摩尔）。 活动现场溶剂化和水源的2型号模拟退火后，运行20纳秒的分子动力学（MD）的轨迹，并通过“文件|另存为|模拟快照”产生至少10快照命令后面加上“仿真”。运行一个标准的计算机上模拟下正则系综周期性边界条件。保持在298K使用Berendsen恒温器的温度。 通过删除所有的水分子和最终的配体/基板准备从2.1中获得的快照4;编辑|删除|残留“指令叠加各自单独快照上的原始PDB结构由”叠加|对象“命令，以确保所有的结构共享相同的空间位置减以这种方式作为一个新的PDB制备每个快照。 -file（使用“文件|另存为| PDB”命令）。 注： 对于有经验的建模师：写一个脚本，根据补充代码文件1中给出的模板来自动完成这一过程。 2.2已在三维空间中被排列为输入到软件探洞3.0 19使用准备快照（PDB）。对的快照的一个有限数量的分析，在标准计算机上运行探洞。用0.7埃19的探针半径，以确保隧道是特异于水分子的运输的检测。 通过可视化3.0探洞在分子图形软件生成的隧道。对于隧道方便的可视化，使用补充代码费尔显示的宏Ë2。 3. 在硅片酶工程修改水模式和水动态按标题“ID”输出文件“的Summary.txt”从探洞3.0软件生成列出确定排名最高的隧道。 确定氨基酸衬排名最高的隧道（3.1），并且显示小侧链指向通过视觉检查（使用从2.4中获得的模型）的通道内。识别单个氨基酸取代，这会阻碍隧道通过使用“交换残渣”命令增加空间位阻。验证该隧道通过目测妨碍，然后通过重复步骤的协议的1.2-3.1。 突变基因的4表达使用非重叠的引物20，在野生型基因通过诱变PCR引入突变。 添加包含感兴趣的管中的基因的质粒DNAs的合适的克隆菌株的感受态细胞，并在冰上孵育30分钟。设置为42℃的温度下进行45秒的热休克转化在水浴中。加入500微升新鲜富培养基（2YT 16克/升胰蛋白胨，10克/升酵母提取物，5克/升NaCl）中，并在37℃，200rpm下45分钟。做出选择通过电镀在辅以适当的抗生素琼脂平板上的转化细胞。 验证所述突变基因的DNA序列后，转化将质粒DNA导入使用热休克如上所述的表达菌株。用于膜结合三萜环化酶的表达，使用BL21（DE3）。 开始5ml的O / N培养在2YT媒体辅以适当的抗生素表达菌株的37℃。 接种的2L带挡板摇瓶中，装有300ml的2YT-介质补充有合适的抗生素，以0.05-0.09的最终OD（在600nm测量）。归纳在0.6-0的OD后。8和蛋白的表达，冷冻细胞沉淀，并储存在-80℃。 用于在pD861载体膜结合三萜环化酶，诱导用0.5至2毫鼠李糖和4表达的小时，在37℃以达到21蛋白质的产量高。 5.膜萃取使用普通离心机和蛋白质纯化准备以下缓冲器： 再悬浮缓冲液（100mM磷酸钾，pH 7.5补充有蛋白酶抑制剂片剂）， 洗涤剂缓冲液（1％（体积/体积）的Triton X-100，50mM磷酸钾，pH7.5）中和反应缓冲液（0.2 ％的Triton X-100，50mM磷酸钾，pH7.5）中。 对角鲨烯环化酶hopene或其他膜结合酶与低级最佳pH，取代磷酸钾与柠檬酸盐的再悬浮缓冲液。对于这样的酶使用以下缓冲液： 缓冲液洗涤剂 （1％的Triton X-100，60 mM柠檬酸盐，pH 6.0）中和反应缓冲液（0.2％的Triton-X 100，60 mM柠檬酸盐，pH 6.0）中。 注意：如果His标签被用于纯化，补充重悬浮缓冲液，用20mM咪唑（最终浓度）。 称重在玻璃烧杯中冷冻细胞沉淀。重新悬浮使用均化器，以0.3克细胞/ ml的终浓度中的细胞重悬浮缓冲液。裂解的悬浮细胞通过超声波用的80％的振幅和1秒上至1秒关闭的脉冲。使用的每50秒3的重复周期。 添加洗涤剂缓冲至0.2％（体积/体积）的洗涤剂的最终浓度。通过端过端​​在4℃混合1小时达到平衡。通过保存上清液单个离心步骤在39000×g离心50分钟，在4℃下后回收膜蛋白级分。 注意：如果His标签纯化的情况下，琼脂糖加入约1.5 ml的的Ni-NTA /克细胞孵育1小时。 执行第一次纯化一步无论是离子交换或His标签纯化21。补充平衡和洗脱缓冲液含有0.2％的Triton X-100。浓缩纯化的蛋白质使用离心过滤装置与截止的10 kDa的五倍。 注意：的曲拉通X-100胶束结果在洗涤剂的浓度的大小到大约1％的终浓度。 通过使用浓缩的蛋白质和基质用分级范围为2×10 4 -8×10 6的球状蛋白相容的凝胶过滤抛光步骤完成纯化。用反应缓冲液作为运行缓冲液。通过根据制造商的方案使用Bradford超试剂盒测量纯化的蛋白质的量。 6.动力学使新鲜的5mM储备底物在反应缓冲溶液。获得通过超声波以30％振幅的均匀的乳液为2-5分钟。 平衡一个恒温在所需的反应温度。由外部温度计验证内部含有水的玻璃小瓶的温度。 用于单底物的动力学，稀乳化衬底送入至少五个玻璃小瓶，以相同的最终底物浓度。 对于具有多个基板一锅煮相对动力学，混合所有基板在每个小瓶准备至少五个相同的玻璃小瓶。用于疏水性三萜，用最终底物浓度在10-200微米的范围内。 预孵育的玻璃小瓶在恒温10分钟。开始通过加入酶进行反应。 1毫升甲总反应体积是合适的。至少使用1200 RPM的振荡速度。 通过加入500微升乙酸乙酯停止该反应在不同时间点掺有100μM的癸醇作为集成标准。 7.提取和热力学分析提取反应混合物通过涡旋并手动摇动玻璃小瓶大力1分钟。离心玻璃小瓶在9600 xg离心在台式离心机在室温10分钟。顶部层（有机相）转移到一个空的管中。增加一个额外的500μl的提取溶剂在反应管中，并重复提取步骤。 干燥该萃取反应混合物用 Na 2 SO 4。涡旋5秒并让管休息10分钟。在9600×g离心在RT 1 min，使用台式离心机执行最终离心步骤。传送所提取的样品气相色谱（GC）小瓶中。 重复下6.1-7.2为每个感兴趣的酶变体的步骤，用该衬底的至少四个不同的初始浓度（对于单个衬底动力学）和四个不同的温度（对于单个衬底和竞争动力学）。 如前所述3进行GC-分析。使用非极性柱为hydrophob的分析IC五环的产品。设置初始炉温至120℃，并用5℃/分的温度梯度，根据产品和列。 集成产品（S）的峰面积和变换产物峰面积成相应的产物浓度通过利用整合标准的区域（对应于100μM）。绘制每种产品（[P]）对反应时间（t）的浓度。执行对应于小于10％的转化率数据点的线性回归。在最初的反应速度 （V 0）由下式给出根据拟合直线的斜率： 注意 ：对于具有多个基板的一锅相对动力学，V 0是其它基质的影响下的特定衬底的初始速率。 对于单底物反应动力学，积V 0的 </suB> / [E]对相应的底物浓度。表观ķ 猫 / K M值的由下式给出根据图形的线性部分的斜率： [S]是底物的浓度和[E]中的转换：K 猫使用的酶的浓度/ K m值等于催 ​​化恒定的米氏常数。重复分析每个温度和每个酶变体。 对于单底物反应动力学，根据过渡态理论22进行热力学分析 K B＆是玻尔兹曼常数， 小时普朗克常数 ，T Kelvin温度，并且R是气体常数。执行的LN的情节线性回归分析（（K <sUB>猫/ K M）/（（K B * T）/ H）））与1 / T。的活化焓（Δħ‡）是由（-slope）* R和活化熵（Δ 小号 ‡）是由（截距）* R给出给出。 注意：同样地，饱和底物浓度下的分析可以通过使用该K 猫作为率在等式3常数来执行。 对于具有多个基板一锅煮相对动力学，获得相对明显 ķ 猫 / 23 K m值的值： （K 猫 / K M）A /（K 猫 / K M）B = V 0的 ，A / V 0，B * [B] / [A]（4） 对于因为 V 0，A指的初始速率为衬底A中竞争与基板B 对于一锅煮相对き代动力学与多个基板，获得活化B的相对热力学参数，相对于A为参照，通过非线性回归： 计算从激活焓和参考化合物A熵基板B的绝对激活参数：