Summary

Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato

Published: December 22, 2014
doi:

Summary

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Abstract

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Introduction

Rastreamento de trajeto anatômico é uma das ferramentas mais utilizadas para decifrar a relação entre cérebro e comportamento 1. Avanço nas tecnologias de rastreamento de circuitos neurais concedeu neurocientistas com a capacidade de rastrear circuitos neurais a partir de populações de neurônios geneticamente identificadas em camundongos 2. Apesar desses avanços técnicos que continua sendo um desafio para desvendar a formação de circuitos neurais especialmente durante a maturação embrionária. Isto é porque a maioria dos métodos de rastreio desenvolvidos até à data baseiam-se a injecção estereotáxica de marcadores transsináptica ou vírus neurotrópico geneticamente modificados (Figura 1) 2,3. Embora essas técnicas obter uma resolução espacial e temporal da conectividade, várias limitações inerentes, tais como injecções traçadores tecnicamente difíceis para o desenvolvimento do cérebro, a reprodutibilidade do local da injecção, inflamação potencial no local da injecção e mais importantly citotoxicidade causada por vírus neurotrópicas limitar a sua utilização 4.

Um método alternativo é a de expressar os transgenes marcadores transsináptica como em murganhos geneticamente modificados. Temos recentemente modificado esta técnica e desenvolveu um sistema binário transsináptica genética rastreamento para mapear os circuitos neurais de qualquer população neuronal geneticamente identificado 5. A nossa estratégia experimental baseia-se em duas novas estirpes knock-no rato, que expressam a lectina ou bidirecional cevada traçador (BL) 6 ou o traçador retrógrado fragmento C da toxina do tétano fundido a GFP (GTT) a partir da 7 ROSA 26 lócus após mediada por Cre recombinação. Aqui usamos estas linhagens de camundongos para expressar seletivamente BL e GTT em neurônios que produzem kisspeptin, um neuropeptídeo que está implicado na regulação da maturação do eixo reprodutivo 8,9. Nós demonstramos que esta técnica é adequado para a visualização do desenvolvimento e maturação de ósculocircuitos neurais peptina durante o desenvolvimento embrionário do cérebro do rato fêmea 5.

Estratégia para a criação

O os R26-GFP-TTC (GTT) linhas traçadores R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) e são knock-in cepas 5 que carregam alelos ROSA26 recombinantes. O R26-BIZ e os alelos R26-GTT são transcricionalmente silencioso devido à presença de um sinal de paragem da transcrição forte, que é flanqueado por dois sítios loxP 5. A expressão do transgene e BIZ GTT é activado por remoção mediada por Cre do sinal de paragem da transcrição. Os alelos-R26 e R26-BIZ GTT pode ser usado de forma independente através da simples cruzamento com uma linha de condutor Cre. Para os animais de análise heterozigótica para os respectivos alelos Cre e R26 pode ser usado. Da mesma ninhada que transportam uma Cre ou um alelo R26, respectivamente, devem ser utilizadas como controlos. Em alternativa, também é possível gerar triple knock-nos animais com os alelos Cre, R26 e R26-BIZ-GTT, porém isso vai exigir uma cruz adicional.

Protocol

NOTA: Ética Declaração: os procedimentos de indivíduos animais foram aprovados pelo comitê de bem-estar dos animais, da Universidade de Hamburgo e da Universidade de Saarland. 1. Preparação e fixação de tecido embrionário Organizar todos os equipamentos necessários para dissecar os embriões e preparar soluções para posterior fixação do tecido antes de sacrificar os animais. NOTA: Sempre preparar uma nova solução de 4% de paraformaldeído (PFA) (PFA a 4% em…

Representative Results

Esta seção apresenta os resultados representativos que podem ser obtidos a trabalhar com o R26-BIZ (B L- I RES-τlac Z) e o R26-GTT (G FP- TT C) alelos. Aqui usamos o R26-BIZ e os alelos R26-GTT para analisar a maturação dos circuitos neurais que regulam o eixo reprodutivo. Reprodução em vertebrados está centralmente controlada por um pequeno subconjunto de neurônios no hipotálamo, que secretam hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH). Kisspept…

Discussion

Expressando traçadores transsináptica como transgenes para rastrear os circuitos neurais das populações neuronais geneticamente definidos tem várias vantagens em comparação com a injeção estereotáxica de marcadores ou vírus neurotopic. Em primeiro lugar, o marcador é produzido como uma proteína endógena e, por conseguinte, não provocam qualquer resposta imune e uma via neural selectiva pode ser analisada em diferentes animais com elevada reprodutibilidade. Em segundo lugar, porque este é um método não-…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Michael Candlish for critical comments on the manuscript. This project was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft grants BO1743/6 and SFB/TRR 152 P11 and Z02 to Ulrich Boehm.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) Sigma 14530-100MG
Ethanol Sigma 32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way) Polyscience Inc. 18646A-1 22mm x 22mm x 20mm
DMSO Sigma D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF) VWR Chemicals 23470,293
EGTA ROTH 3054.3
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glutaraldehyde Sigma G5882-50ML
Hydrogen peroxide Sigma 34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane) Sigma M32631-2.5L
Kaiser's Glycine gelatin Merck 1092420100
Methanol Sigma 494437-1L
MgCl2 Sigma M2670-100G
NaCl ROTH HN00.2
NBT Sigma 298-83-9
Nonidet P40 substitute Fluka 743.85
OCT Leica 14020108926
PAP pen Dako S2002
Parafarmaldehyde Sigma P6148-1KG
Sodium deoxycholate Sigma D6750-25G
Sucrose Sigma S7903-1KG
Superfrost slides Thermo Scientific FT4981GLPLUS
TSA kit PerkinElmer  NEL700
TSA plus kit PerkinElmer  NEL749A001KT
Tris ROTH AE15.2
Triton-X 100 ROTH 3051.2
Tween 20 ROTH 9127.1
X-gal ROTH 2315.1
Cryostat Leica na
Light microscope equipped with DIC imaging  Zeiss Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope Zeiss Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop Adobe PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL) Vector Laboatories AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG Vector Laboatories BA-9500 
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboatories BA-1000 
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) Invitrogen A11122
Rabbit anti-GnRH Affinity Bio Reagent PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG Thermo Scientific SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546 Life Technologies S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping) Eurofins MWG Operon  ATGAAGATGATGAGCACCAG
GGC 
BL Rev  (for BIZ genotyping) Eurofins MWG Operon  AGCCCTCGCCGCAGAACTC 
Cre Fwd  (for Cre genotyping) Eurofins MWG Operon GTCGATGCAACGAGTGATGAG
GTTCG
Cre Rev  (for Cre genotyping) Eurofins MWG Operon CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTAC
ACCTGC
TTC Fwd  (for GTT genotyping) Eurofins MWG Operon AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev  (for GTT genotyping) Eurofins MWG Operon GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCT
TGAA
XY Fwd (for gender genotyping) Eurofins MWG Operon TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev  (for gender genotyping) Eurofins MWG Operon CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd Eurofins MWG Operon CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev Eurofins MWG Operon GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev Eurofins MWG Operon CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC

References

  1. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
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Cite This Article
Kumar, D., Boehm, U. Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain. J. Vis. Exp. (94), e52487, doi:10.3791/52487 (2014).

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