Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen

Anatomische pad tracing is een van de meest gebruikte middelen om de relatie tussen hersenen en gedrag ¹ ontcijferen. Vooruitgang in de neurale circuit tracing technologieën heeft neurowetenschappers geschonken met de mogelijkheid om neurale circuits sporen van genetisch geïdentificeerd neuron bevolking in muizen ^2. Ondanks deze technische vooruitgang blijft een uitdaging om de vorming van neurale circuits ontrafelen vooral tijdens embryonale ontwikkeling. Dit is omdat de meeste van de tracering worden ontwikkeld tijd berusten op stereotaxische injectie van transsynaptische tracers of genetisch gemodificeerde neurotrope virussen (figuur 1) ^2,3. Hoewel deze technieken te bereiken ruimtelijke en temporele resolutie van connectiviteit, een aantal inherente beperkingen, zoals technisch uitdagende tracer injecties in de ontwikkeling van de hersenen, de reproduceerbaarheid van de plaats van injectie, potentiële ontsteking op de injectieplaats en de meeste belang-tantly cytotoxiciteit veroorzaakt door neurotrope virussen beperken hun gebruik ^4.

Een alternatieve methode is het transsynaptische tracers als transgenen in genetisch gemanipuleerde muizen tot expressie. We hebben recent gewijzigde deze techniek en ontwikkelde een binaire genetische transsynaptische tracing systeem om de neurale circuits van elk genetisch geïdentificeerd neuronale populatie ⁵ in kaart. Onze experimentele strategie is gebaseerd op twee nieuwe knock-in muizen stammen, die ofwel de bidirectionele merker gerst lectine (BL) ⁶ of retrograde tracer tetanustoxinefragment C gefuseerd aan GFP (GTT) ⁷ van de ROSA 26 locus kenbaar na Cre gemedieerde recombinatie. Hier gebruiken we deze muis stammen om selectief te uiten BL en GTT in neuronen die kisspeptin produceren, een neuropeptide dat betrokken is bij het ​​reguleren van de rijping van de reproductieve as ^8,9. We tonen aan dat deze techniek geschikt is voor de ontwikkeling en rijping van kiss visualiserenpeptin neurale circuits tijdens de embryonale ontwikkeling van de vrouwelijke hersenen van muizen ^5.

Kweekstrategie

De R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) en de R26-GFP-TTC (GTT) tracer lijnen zijn knock-in stammen ⁵ dat recombinant ROSA26 allelen dragen. De R26-BIZ en R26-GTT allelen transcriptioneel stil door de aanwezigheid van een sterk transcriptie stopsignaal, die wordt geflankeerd door twee loxP plaatsen ^5. Expressie van de BIZ en GTT transgen wordt geactiveerd door Cre gemedieerde verwijdering van de transcriptie stopsignaal. De R26-BIZ en R26-GTT allelen kunnen onafhankelijk door simpelweg kruising met een Cre bestuurder lijn worden gebruikt. Voor analyse dieren heterozygoot voor de respectievelijke Cre en R26 allelen kunnen worden gebruikt. Nestgenoten die één Cre of een allel R26, respectievelijk, worden gebruikt als controles. Als alternatief is het ook mogelijk om t genererenriple knock-in dieren die het Cre, R26-BIZ en R26-GTT allelen, maar dit zal een extra kruis nodig.