Summary

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Published: January 28, 2015
doi:

Summary

I livelli di proteine ​​nelle cellule e tessuti sono spesso strettamente regolati dal saldo della produzione di proteine ​​e di liquidazione. Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), la cinetica di clearance di proteine ​​possono essere sperimentalmente misurati in vivo.

Abstract

Stabilità della proteina influenza molti aspetti della biologia, e misurando la cinetica di clearance di proteine ​​in grado di fornire importanti informazioni nei sistemi biologici. In esperimenti FDAP, la clearance di proteine ​​negli organismi viventi può essere misurata. Una proteina di interesse è etichettato con una proteina fluorescente fotoconvertibile, espresso in vivo e photoconverted, e la diminuzione del segnale di photoconverted nel tempo è monitorato. I dati vengono poi dotata di un modello di clearance appropriato per determinare la proteina emivita. È importante sottolineare che la cinetica di clearance delle popolazioni di proteine ​​in diversi comparti dell'organismo possono essere esaminati separatamente applicando maschere compartimentali. Questo approccio è stato utilizzato per determinare l'emivita intra- ed extracellulari di proteine ​​di segnalazione secrete durante lo sviluppo zebrafish. Qui, descriviamo un protocollo per la sperimentazione FDAP in embrioni di zebrafish. Dovrebbe essere possibile utilizzare FDAP per determinare la cinetica di liquidazioneogni proteina oggetto di tag in ogni organismo otticamente accessibile.

Introduction

I livelli di proteine ​​nelle cellule ed organismi sono determinati dalla loro tassi di produzione e passaggio. Protein dimezzamento possono variare da minuti a giorni 1-4. In molti sistemi biologici, la stabilizzazione o liquidazione di proteine ​​chiave ha effetti importanti sulla attività cellulare. È necessaria modulazione di stabilità proteina intracellulare per la progressione del ciclo cellulare 5,6, segnalazione di sviluppo 7-9, apoptosi 10, e la funzione normale e la manutenzione dei neuroni 11,12. Stabilità della proteina extracellulare influenza la distribuzione e la disponibilità di proteine ​​secrete, come morphogens 13,14, all'interno di un tessuto.

Negli ultimi decenni, la stabilità della proteina è stata valutata principalmente in coltura cellulare utilizzando radioattivo pulse-etichettatura o esperimenti chase cicloesimide 15. In tali esperimenti pulse-chase, le cellule sono o transitoriamente esposti ad un "impulso" di amino radioattiviprecursori di acidi che sono incorporati in proteine ​​di nuova sintesi, o sono esposti a cicloesimide, che inibisce la sintesi proteica. Cellule coltivate vengono poi raccolti in diversi momenti, e sia immunoprecipitazione seguita da autoradiografia (in radioattive esperimenti pulse-chase) o occidentale assorbente (in esperimenti cicloesimide) viene utilizzato per quantificare il gioco di proteine ​​nel corso del tempo.

Test di stabilità proteica convenzionali hanno diverse lacune. Innanzitutto, proteine ​​in questi saggi sono spesso non espressi in loro ambienti endogeni, ma piuttosto in coltura tissutale e talvolta in cellule di specie diverse. Per proteine ​​la cui stabilità è dipendente dal contesto, questo approccio è problematico. In secondo luogo, non è possibile seguire la clearance proteine ​​in singole cellule o organismi nel tempo, ed i dati da questi saggi riflette una media delle diverse popolazioni di cellule a tempi diversi. Poiché le cellule individuali possono avere iniziatocon diverse quantità di proteine, potrebbe aver preso l'etichetta o cicloesimmide radioattivo in tempi diversi, o può avere diverse cinetiche di liquidazione, tali dati aggregati potrebbero essere fuorvianti. Infine, nel caso di esperimenti chase cicloeximide, aggiunta del inibitore della sintesi proteica può avere effetti fisiologici indesiderati che potrebbero alterare artificialmente stabilità proteica 16-18. Queste carenze possono essere evitati utilizzando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), una tecnica che utilizza le proteine ​​fotoconvertibile per misurare il gioco di proteine ​​in modo dinamico in organismi viventi 19-25 (vedi la discussione per le limitazioni della tecnica FDAP).

Proteine ​​fotoconvertibile sono proteine ​​fluorescenti la cui eccitazione e di emissione di proprietà cambiare dopo l'esposizione a specifiche lunghezze d'onda della luce 26. Una variante comunemente usata è Dendra2, una proteina fotoconvertibile "green-to-rossa", che ha inizialmente excitazioni ed emissione proprietà simili alle proteine ​​fluorescenti verdi, ma dopo l'esposizione a "fotoconversione" UV light- -il eccitazione / proprietà di emissione diventano simili a quelle delle proteine ​​fluorescenti rosse 23,27. È importante sottolineare che, nuova proteina prodotta dopo fotoconversione non avrà le stesse proprietà di eccitazione / emissione come la proteina photoconverted, permettendo disaccoppiamento della produzione e la clearance su fotoconversione e l'osservazione di solo un pool di proteine ​​photoconverted. Tagging proteine ​​di interesse con le proteine ​​fotoconvertibile fornisce quindi un modo conveniente per impulsi-label proteine ​​intatte, organismi viventi otticamente accessibili.

In saggi FDAP (Figura 1A), una proteina di interesse è etichettato con una proteina fotoconvertibile ed espressa in un organismo vivente (Figura 1B). La proteina di fusione è photoconverted, e la diminuzione del segnale photoconverted nel tempo è monitorato da fluorescenmicroscopia ce (Figura 1C). I dati vengono poi dotato di un modello appropriato per determinare l'emivita della proteina di fusione (Figura 1D).

Il test FDAP qui descritto è stato progettato per determinare l'emivita extracellulari di proteine ​​di segnalazione secrete in embrioni di zebrafish durante la prima embriogenesi 19. Tuttavia, questo approccio può essere adattato a qualsiasi organismo modello trasparente che tollera imaging dal vivo, e potrebbe essere usato per monitorare il passaggio di qualsiasi proteina intracellulare o extracellulare oggetto di tag. Variazioni della tecnica qui descritta sono stati effettuati in cellule in coltura 20,23 e 22 Drosophila e topo di 21 embrioni.

Protocol

1. Creazione di un fotoconvertibile Fusion Costruire e Iniettare dechorionated embrioni di zebrafish Generare un costrutto funzionale contenente la proteina di interesse fusa ad una proteina fotoconvertibile verde a rosso (vedi Discussione), quindi utilizzare la trascrizione in vitro per generare capped mRNA codificante la proteina di fusione come nel Müller et al., 2012 19. Utilizzare pronasi per rimuovere le chorions da circa 30 embrioni di zebrafish …

Representative Results

FDAP è stata utilizzata per determinare l'emivita di proteine ​​di segnalazione extracellulari in embrioni di zebrafish 19. Una di queste proteine, Squint, induce l'espressione di geni mesendodermal durante l'embriogenesi 34. Strabismo-Dendra2 attiva l'espressione di geni mesendodermal a livelli simili a untagged Squint, come dimostrato da qRT-PCR e ibridazione in situ test 19. Gli embrioni sono stati co-iniettate con Alexa488 destrano e mRNA codifica Squint…

Discussion

Il successo di un esperimento FDAP si basa sulla generazione di una proteina di fusione fotoconvertibile funzionale. Tagging una proteina può compromettere la sua attività biologica e / o proprietà biofisiche, tra cui la sua localizzazione, solubilità, stabilità e 36-41. Siate pronti a testare l'attività di diversi costrutti di fusione diversi al fine di trovare uno che è attiva. Abbiamo trovato che la modifica della posizione della proteina fotoconvertibile relativa alla proteina di interesse o ut…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Jeffrey Farrell, James Gagnon, e Jennifer Bergmann per i commenti sul manoscritto. KWR è stato sostenuto dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program durante lo sviluppo del test FDAP. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH di AFS e da finanziamenti della Fondazione tedesca per la ricerca (Emmy Noether Program), il Max Planck Society, e il Programma Umana Frontier Science (Career Development Award) per PM.

Materials

PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish (BD Falcon) Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass petri dish For embryo dechorionation
200 ml glass beaker For embryo dechorionation
Microinjection apparatus For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use
Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium  For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals 
25x or 40x water objective Objective for imaging
10x air objective Objective for photoconversion
Immersion oil Immersion oil with the same refractive index as water

References

  1. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
  3. Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O’Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
  4. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  5. Parry, D. H., O’Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
  6. Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
  7. Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
  8. MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
  9. Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
  10. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  11. Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
  12. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  13. Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
  14. Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -. Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
  15. Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
  16. Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
  17. Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
  18. Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
  19. Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
  20. Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
  21. Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
  22. Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
  23. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
  24. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
  25. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
  26. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  27. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  28. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  29. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  30. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  31. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
  32. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  33. Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
  34. Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
  35. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
  36. Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
  37. Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
  38. Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
  39. Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
  40. Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
  41. Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
  42. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  44. Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
  45. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  46. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  47. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
  48. Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
  49. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  50. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
  51. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
  52. Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
  53. Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
  54. Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
  55. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
  56. Bläßle, A., Müller, P. . PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, (2014).

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Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP). J. Vis. Exp. (95), e52266, doi:10.3791/52266 (2015).

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