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발생학

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Published: January 28, 2015
doi:
10.3791/52266
, , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Harvard University, 2Systems Biology of Development Group,Friedrich Miescher Laboratory of the Max Planck Society

Summary

Protein-Spiegel in Zellen und Geweben werden oft dicht durch das Gleichgewicht der Proteinproduktion und Freigabe geregelt. Verwendung Fluoreszenzabklingzeit Nach Photokonversion (FDAP) können die Clearance-Kinetik von Proteinen experimentell in vivo gemessen werden.

Abstract

Proteinstabilität beeinflusst viele Aspekte der Biologie und der Messung der Abstand Kinetik der Proteine ​​können wichtige Einblicke in biologische Systeme. In FDAP Experimenten kann die Clearance von Proteinen in lebenden Organismen zu messen. Ein Protein von Interesse wird mit einem Photokonvertierbare fluoreszierendes Protein markiert ist, ausgedrückt in vivo und Photokonversion und die Abnahme der photokonvertiertem Signals über die Zeit überwacht wird. Die Daten werden dann mit einem geeigneten Spaltmodell, um die Proteinhalbwertszeit zu bestimmen, ausgestattet. Wichtig ist, dass die Clearance-Kinetik der Proteinpopulationen in verschiedenen Kompartimenten des Organismus getrennt durch Anlegen compartmental Masken untersucht werden. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die intra- und extrazelluläre Halbwertszeiten von sekretierten Signalproteinen während Zebrabärblingentwicklung bestimmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für FDAP Experimente im Zebrafischembryonen. Es sollte möglich sein, FDAP verwenden, um den Abstand Kinetik bestimmenjede taggable Protein in jedem optisch zugänglich Organismus.

Introduction

Die Niveaus von Proteinen in Zellen und Organismen werden durch ihre Produktionsraten und Clearance bestimmt. Proteinhalbwertszeiten kann von Minuten bis Tagen 1-4 liegen. In vielen biologischen Systemen, die Stabilisierung oder Verrechnung von Schlüsselproteinen hat wichtige Auswirkungen auf die Zellaktivität. Modulation der intrazellulären Proteinstabilität ist für die Zellzyklusprogression 5,6, entwicklungsSignalisierungs 7-9, Apoptose 10, und die normale Funktion und Wartung der Neuronen 11,12 erforderlich. Extrazelluläre Proteinstabilität beeinflusst die Verteilung und Verfügbarkeit von sezernierten Proteinen, wie Morphogene 13,14, innerhalb eines Gewebes.

Im Laufe der letzten Jahrzehnte, die Proteinstabilität wurde vor allem in der Zellkultur mit radioaktivem Pulsmarkierung oder Cycloheximid Chase-Experimente 15 bewertet. In solchen Pulse-Chase-Experimente werden die Zellen entweder transient zu einem "Impuls" von radioaktiven Aminosäure ausgesetztSäurevorläufer, die in den neu synthetisierten Proteine ​​eingebaut werden, oder sie können gegen Cycloheximid, das die Proteinsynthese hemmt, ausgesetzt sind. Die kultivierten Zellen werden dann zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt und entweder Immunfällung, gefolgt von Autoradiographie (radioaktive Pulse-Chase-Experimente) oder Western Blot (in Cycloheximid Versuchen) wird verwendet, um die Clearance des Proteins über die Zeit quantifiziert.

Herkömmliche Proteinstabilität Tests haben mehrere Nachteile. Zuerst Proteine ​​in diesen Assays werden häufig nicht in ihrer endogenen Umgebungen exprimiert, sondern in der Gewebekultur und manchmal in Zellen aus unterschiedlichen Spezies. Für Proteine, deren Stabilität ist kontextabhängig, ist dieser Ansatz problematisch. Zweitens ist es nicht möglich, Proteinclearance in einzelnen Zellen oder Organismen mit der Zeit zu folgen, und die Daten aus diesen Tests reflektiert ein Durchschnitt der verschiedenen Populationen von Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten. Da einzelne Zellen begonnen habenmit unterschiedlichen Mengen an Eiweiß, kann die radioaktive Markierung oder Cycloheximid zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen wurden, oder können unterschiedliche Clearance-Kinetik, wie aggregierte Daten irreführend sein können. Schließlich wird in dem Fall von Cycloheximid Chase-Experimente, Zugabe der Proteinsynthese-Inhibitor kann unbeabsichtigte physiologischen Wirkungen, die Proteinstabilität 16-18 künstlich verändern könnten. Diese Mängel können mit Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP), eine Technik, die Photokonvertierbare Proteine ​​zu Protein-Clearance dynamisch in lebenden Organismen 19-25 messen nutzt vermieden werden (siehe Diskussion für Beschränkungen des FDAP Technik).

Photokonvertierbare Proteine ​​fluoreszierende Proteine, deren Anregungs- und Emissionseigenschaften zu ändern nach der Exposition auf bestimmte Wellenlängen des Lichts 26. Eine häufig verwendete Variante ist Dendra2, eine "grüne-to-rot" Photokonvertierbare Protein, das anfangs abZitat und Emissionseigenschaften ähnlich wie das grün fluoreszierende Proteine, aber nach der Einwirkung von UV-Licht- "Photo" -seine Anregungs- / Emissionseigenschaften werden ähnlich denen der rote fluoreszierende Proteine ​​23,27. Wichtig ist, dass neue Protein nach Photo erzeugt nicht denselben Anregungs- / Emissionseigenschaften wie die photokonvertiertem Proteins ermöglicht Entkoppelung der Produktion und Clearance auf Photo und Beobachtung von nur einem Pool von photokonvertiertem Protein. Kennzeichnen von interessierenden Proteine ​​mit Photokonvertierbare Proteine ​​stellt somit eine bequeme Möglichkeit, impuls Label Proteinen in intakten, optisch zugänglichen lebenden Organismen.

In FDAP Assays (Abbildung 1A) ist ein Protein von Interesse mit einem Photokonvertierbare Protein markiert und ausgedrückt in einem lebenden Organismus (1B). Das Fusionsprotein wird durch Photo, und die Abnahme der photokonvertiertem Signals über die Zeit ist durch fluorescen wachtence-Mikroskopie (Abbildung 1C). Die Daten werden dann mit einem geeigneten Modell angebracht, um die Halbwertszeit des Fusionsproteins (1D) zu bestimmen.

Die hier beschriebene FDAP Assay wurde entwickelt, um die extrazelluläre Halbwertszeiten von sekretierten Signalproteinen in Zebrafischembryos der frühen Embryogenese 19 bestimmen. Allerdings kann dieser Ansatz für jeden transparent Modellorganismus, die Live-Bildgebung toleriert, und könnte verwendet werden, um den Abstand von jedem taggable intrazelluläre oder extrazelluläre Protein zu überwachen angepasst werden. Variationen der hier beschriebenen Technik wurden in kultivierten Zellen 20,23 und Drosophila 22 und der Maus 21 Embryos durchgeführt.

Protocol

1. Erstellen eines Photokonvertierbare Fusionskonstrukt und Spritzen dechorionated Zebrafischembryonen Erzeugen Sie eine funktionale Konstruktion des Proteins von Interesse zu einer grünen-to-rot Photokonvertierbare Protein (siehe Diskussion) fusioniert enthält, dann verwenden Sie in vitro-Transkription zur mRNA mit Cap erzeugen das Fusionsprotein kodiert, wie in Müller et al., 2012 19. Verwenden Pronase die Chorion von etwa 30 Zebrafischembryonen im …

Representative Results

FDAP verwendet worden, um die Halbwertszeiten von extrazellulärer Signalproteine ​​in Zebrafischembryos 19 bestimmen. Eines dieser Proteine, Schielen, induziert die Expression von Genen während der Embryogenese mesendodermal 34. Schielen-Dendra2 aktiviert die Expression von Genen mesendodermal auf einem ähnlichen Niveau untagged Schielen, wie qRT-PCR und in situ-Hybridisierungsassays 19 demonstriert. Die Embryonen wurden mit Alexa488-Dextran und mRNA Schiel Dendra2 und au…

Discussion

Der Erfolg einer FDAP Experiments beruht auf der Erzeugung eines funktionellen Photokonvertierbare Fusionsprotein. Markierung eines Proteins kann seine biologische Aktivität und / oder biophysikalischen Eigenschaften, einschließlich der Lokalisierung, Löslichkeit und Stabilität 36-41 betreffen. Werden hergestellt, um die Aktivität von mehreren verschiedenen Fusionskonstrukte zu testen, um eine, die aktiv ist, zu finden. Wir haben festgestellt, dass eine Änderung der Position des Photokonvertierbare Prot…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Jeffrey Farrell, James Gagnon, und Jennifer Bergmann für Kommentare zum Manuskript danken. KWR wurde von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship-Programm bei der Entwicklung des FDAP Test unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH, um AFS und durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Emmy Noether-Programm), das Max-Planck-Gesellschaft und des Human Frontier Science Program (Career Development Award) an PM unterstützt.

Materials

PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish (BD Falcon) Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass petri dish For embryo dechorionation
200 ml glass beaker For embryo dechorionation
Microinjection apparatus For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use
Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium  For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals 
25x or 40x water objective Objective for imaging
10x air objective Objective for photoconversion
Immersion oil Immersion oil with the same refractive index as water
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Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP). J. Vis. Exp. (95), e52266, doi:10.3791/52266 (2015).
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