Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Os níveis de proteínas em células e organismos são determinados através das suas taxas de produção e de depuração. Proteína de semi-vida pode variar de minutos a dias ^1-4. Em muitos sistemas biológicos, a estabilização ou limpeza de proteínas-chave tem efeitos importantes sobre a atividade celular. Modulação da estabilidade da proteína intracelular é necessário para a progressão do ciclo celular ^5,6, sinalização de desenvolvimento ^7-9, apoptose ^10, e a função normal e manutenção de neurónios ^11,12. A estabilidade da proteína extracelular afecta a distribuição e disponibilidade de proteínas segregadas, tais como morfogénios ^13,14, dentro de um tecido.

Ao longo das últimas décadas, a estabilidade da proteína foi avaliado principalmente em cultura de células usando radioativo pulso de rotulagem ou experiências de perseguição cicloheximida ^15. Nesses experimentos pulse-chase, as células são transitoriamente ou expostos a um "pulso" de amino radioativoprecursores de ácidos que são incorporados em proteínas sintetizadas de novo, ou eles são expostos a ciclo-heximida, a qual inibe a síntese proteica. As células em cultura são então recolhidos em diferentes pontos de tempo, e, ou imunoprecipitação seguido por autorradiografia (em experiências de pulse-chase radioactivos) ou imunodetecção (em experiências de cicloheximida) é utilizada para quantificar a depuração de proteína ao longo do tempo.

Ensaios de estabilidade proteína convencionais têm várias deficiências. Primeiro, as proteínas nestes ensaios frequentemente não são expressos nos seus ambientes endógenos, mas sim em cultura de tecidos e por vezes em células a partir de espécies diferentes. Para proteínas cuja estabilidade é dependente do contexto, esta abordagem é problemática. Em segundo lugar, não é possível seguir a depuração de proteínas em células individuais ou organismos ao longo do tempo, e os dados obtidos nestes ensaios reflecte uma média de diferentes populações de células em diferentes pontos de tempo. Como as células individuais podem ter começadocom diferentes quantidades de proteína, pode ter retomado o marcador radioactivo ou cycloheximide em momentos diferentes, ou podem ter diferentes cinética de depuração, tais dados agregados pode ser enganador. Finalmente, no caso das experiências de perseguição cicloheximida, adição do inibidor da síntese de proteína pode ter efeitos fisiológicos não desejadas que podem alterar a estabilidade da proteína ^16-18 artificialmente. Estas deficiências podem ser evitadas através do uso de fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), uma técnica que utiliza proteínas photoconvertible para medir folga proteína dinamicamente nos organismos vivos ^19-25 (ver discussão para limitações da técnica FDAP).

Photoconvertible proteínas são proteínas fluorescentes cuja excitação e emissão propriedades mudam após exposição a determinados comprimentos de onda de luz ^26. Uma variante comumente usado é Dendra2, uma proteína photoconvertible "verde-to-vermelho", que tem inicialmente excitação de emissão e propriedades semelhantes às proteínas fluorescentes verdes, mas após a exposição à radiação UV luz- "fotoconversão" -sua excitação / emissão de propriedades tornam-se semelhantes às das proteínas fluorescentes vermelhas ^23,27. Importante, nova proteína produzida após fotoconversão não têm as mesmas propriedades de excitação / emissão como a proteína photoconverted, permitindo a dissociação da produção de depuração e em cima fotoconversão e observação de apenas um conjunto de proteínas photoconverted. Marcação de proteínas de interesse com proteínas photoconvertible, portanto, fornece uma maneira conveniente de pulso de rótulo proteínas intactas, organismos vivos opticamente acessíveis.

Em ensaios FDAP (Figura 1A), uma proteína de interesse é marcado com uma proteína photoconvertible e expressa num organismo vivo (Figura 1B). A proteína de fusão é photoconverted, e a diminuição do sinal de photoconverted ao longo do tempo é monitorizado por fluorescenmicroscopia ce (Figura 1C). Os dados são então montados com um modelo apropriado para determinar a meia-vida da proteína de fusão (Figura 1D).

O ensaio aqui descrito FDAP foi desenhado para determinar as semividas extracelulares de proteínas de sinalização segregadas em embriões de peixe-zebra durante a embriogénese precoce ^19. No entanto, esta abordagem pode ser adaptada para qualquer organismo modelo transparente que tolera imagens ao vivo, e pode ser utilizado para monitorar a depuração de qualquer proteína intracelular ou extracelular taggable. As variações da técnica aqui descrita não tem sido realizada em células em cultura e ^20,23 Drosophila ²² e ²¹ embriões de ratinho.