Summary

Mesure de la stabilité des protéines dans le salon embryons de poissons zèbres en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP)

Published: January 28, 2015
doi:

Summary

Les teneurs en protéines dans les cellules et les tissus sont souvent étroitement réglementées par l'équilibre de la production de protéines et de dégagement. En utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), la cinétique de dégagement de protéines peuvent être mesurées expérimentalement in vivo.

Abstract

la stabilité des protéines influence de nombreux aspects de la biologie, et de mesurer la cinétique de libération de protéines peut fournir des informations importantes sur les systèmes biologiques. Dans les expériences FDAP, la clairance de protéines dans les organismes vivants peut être mesurée. Une protéine d'intérêt est marquée avec une protéine fluorescente photoconvertible, exprimée in vivo et photoconverted, et la diminution du signal dans le temps photoconverted est surveillée. Les données sont ensuite muni d'un modèle d'autorisation approprié pour déterminer la demi-vie de la protéine. Fait important, la cinétique de libération des populations de protéines dans les différents compartiments de l'organisme peuvent être examinées séparément en appliquant des masques à compartiments. Cette approche a été utilisée pour déterminer les demi-vies intra- et extracellulaires de protéines de signalisation sécrétées pendant le développement du poisson zèbre. Ici, nous décrivons un protocole pour des expériences FDAP dans embryons de poisson zèbre. Il devrait être possible d'utiliser FDAP pour déterminer la cinétique de libération detoute protéine tagable dans tout organisme optiquement accessible.

Introduction

Les niveaux de protéines dans des cellules et des organismes sont déterminés par leurs taux de production et de dégagement. Protéines demi-vie peut varier de quelques minutes à 1-4 jours. Dans de nombreux systèmes biologiques, la stabilisation ou la clairance de protéines clés a des effets importants sur l'activité cellulaire. La modulation de stabilité de la protéine intracellulaire est nécessaire pour la progression du cycle cellulaire de 5,6, la signalisation du développement 7-9, 10 l'apoptose, et la fonction normale et le maintien des neurones 11,12. La stabilité des protéines extracellulaires affecte la distribution et la disponibilité des protéines sécrétées, telles que 13,14 morphogènes, dans un tissu.

Au cours des dernières décennies, la stabilité des protéines a été évaluée principalement dans la culture de cellule à l'aide d'impulsions marquage radioactif ou d'expériences de chasse cycloheximide 15. Dans ces expériences pulse-chase, les cellules sont soit transitoirement exposées à un «pouls» de aminés radioactifsprécurseurs acides qui sont incorporés dans des protéines nouvellement synthétisées, ou ils sont exposés à la cycloheximide, qui inhibe la synthèse des protéines. Les cellules cultivées sont ensuite recueillies à différents points dans le temps, ainsi que d'une immunoprécipitation suivie d'une autoradiographie (en radioactives expériences pulse-chase) ou western blot (dans des expériences de cycloheximide) est utilisé pour quantifier la clairance de la protéine au fil du temps.

Classiques tests de stabilité des protéines présentent plusieurs inconvénients. Tout d'abord, les protéines dans ces dosages sont souvent pas exprimées dans leurs environnements endogènes, mais plutôt dans une culture tissulaire et parfois dans des cellules provenant d'espèces différentes. Pour les protéines dont la stabilité dépend du contexte, cette approche est problématique. Deuxièmement, il ne est pas possible de suivre la clairance de la protéine dans des cellules ou des organismes individuels au cours du temps, et les données provenant de ces essais reflète une moyenne de différentes populations de cellules à différents points dans le temps. Depuis cellules individuelles peuvent avoir commencéavec différentes quantités de protéines, peut avoir pris l'étiquette ou cycloheximide radioactifs à des moments différents, ou peuvent avoir différents cinétique d'élimination, ces données agrégées peuvent être trompeuses. Enfin, dans le cas d'expériences de chasse cycloheximide, l'addition de l'inhibiteur de la synthèse des protéines peut avoir des effets physiologiques non désirées qui pourraient modifier artificiellement la stabilité des protéines de 16 à 18. Ces lacunes peuvent être évités en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), une technique qui utilise des protéines photoconvertible pour mesurer la clairance de la protéine dynamiquement dans les organismes vivant 19-25 (voir Discussion des limitations de la technique FDAP).

Photoconvertible protéines sont des protéines fluorescentes dont excitation et d'émission propriétés changer après une exposition à des longueurs d'onde spécifiques de la lumière 26. Une variante couramment utilisé est Dendra2, une protéine "vert au rouge» photoconvertible qui a initialement excitations et d'émission des propriétés similaires aux protéines fluorescentes vertes, mais après une exposition à "la photoconversion" de -son excitation UV / propriétés d'émission deviennent semblables à celles des protéines fluorescentes rouges 23,27. Surtout, nouvelle protéine produite après photoconversion ne aura pas les mêmes propriétés d'excitation / émission que la protéine photoconverted, permettant découplage de la production et de la clairance à la photoconversion et l'observation de seulement une piscine de protéines photoconverted. Marquage des protéines d'intérêt avec des protéines photoconvertible fournit ainsi un moyen pratique d'impulsion-étiquette protéines dans les organismes vivants intacts, optiquement accessibles.

Dans les dosages de FDAP (Figure 1A), une protéine d'intérêt est marquée avec une protéine photoconvertible et exprimé dans un organisme vivant (figure 1B). La protéine de fusion est photoconverted, et la diminution du signal photoconverted cours du temps est suivie par fluorescenMicroscopie CE (figure 1C). Les données sont ensuite équipé d'un modèle approprié pour déterminer la demi-vie de la protéine de fusion (Figure 1D).

Le dosage FDAP décrit ici a été conçu pour déterminer les demi-vies extracellulaires de protéines de signalisation sécrétées dans embryons de poisson zèbre au début de l'embryogenèse 19. Cependant, cette approche peut être adapté à tout organisme modèle transparent qui tolère l'imagerie en direct, et pourrait être utilisé pour surveiller le jeu de toute protéine intracellulaire ou extracellulaire tagable. Variations de la technique décrite ici ont été réalisées dans des cellules cultivées 20,23 et 22 drosophile et la souris 21 embryons.

Protocol

1. Création d'un Fusion photoconvertible construire et d'embryons de poissons zèbres Injecter dechorionated Générer une construction fonctionnelle contenant la protéine d'intérêt fusionnée à une protéine du vert au rouge photoconvertible (voir Discussion), puis utilisez la transcription in vitro pour générer plafonné ARNm codant pour la protéine de fusion comme dans Müller et al., 2012 19. Utilisez pronase pour enlever…

Representative Results

FDAP a été utilisé pour déterminer la demi-vie de protéines de signalisation extracellulaires dans 19 embryons de poisson zèbre. Une de ces protéines, strabisme, induit l'expression de gènes de 34 mesendodermal cours de l'embryogenèse. Squint-Dendra2 active l'expression des gènes de mesendodermal à des niveaux similaires à untagged Squint, comme démontré par qRT-PCR et l'hybridation in situ 19 essais. Les embryons sont co-injectés avec Alexa488-dex…

Discussion

Le succès d'une expérience FDAP repose sur la génération d'une protéine de fusion photoconvertible fonctionnel. Une protéine de marquage peut affecter son activité biologique et / ou les propriétés biophysiques, y compris sa localisation, la solubilité, la stabilité et 36 à 41. Soyez prêt à tester l'activité de plusieurs différentes constructions de fusion afin de trouver celui qui est actif. Nous avons trouvé que la modification de la position de la protéine photoconvertible par…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Jeffrey Farrell, James Gagnon, et Jennifer Bergmann des commentaires sur le manuscrit. KWR a été soutenu par le Programme National Science Foundation Graduate Research Fellowship lors de l'élaboration de l'essai FDAP. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH à AFS et par des subventions de la Fondation allemande pour la recherche (programme Emmy Noether), la Société Max Planck, et le Programme Human Frontier Science (Career Development Award) à PM.

Materials

PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish (BD Falcon) Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass petri dish For embryo dechorionation
200 ml glass beaker For embryo dechorionation
Microinjection apparatus For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use
Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium  For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals 
25x or 40x water objective Objective for imaging
10x air objective Objective for photoconversion
Immersion oil Immersion oil with the same refractive index as water

References

  1. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
  3. Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O’Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
  4. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  5. Parry, D. H., O’Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
  6. Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
  7. Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
  8. MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
  9. Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
  10. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  11. Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
  12. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  13. Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
  14. Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -. Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
  15. Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
  16. Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
  17. Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
  18. Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
  19. Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
  20. Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
  21. Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
  22. Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
  23. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
  24. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
  25. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
  26. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  27. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  28. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  29. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  30. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  31. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
  32. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  33. Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
  34. Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
  35. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
  36. Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
  37. Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
  38. Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
  39. Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
  40. Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
  41. Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
  42. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  44. Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
  45. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  46. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  47. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
  48. Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
  49. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  50. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
  51. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
  52. Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
  53. Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
  54. Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
  55. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
  56. Bläßle, A., Müller, P. . PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, (2014).

Play Video

Cite This Article
Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP). J. Vis. Exp. (95), e52266, doi:10.3791/52266 (2015).

View Video