Summary

A gran escala de pez cebra embrionario del corazón Disección de Análisis transcripcional

Published: January 12, 2015
doi:

Summary

Para analizar los perfiles de expresión de genes cardiacos durante el desarrollo del corazón del pez cebra, el ARN total tiene que ser extraído de corazones aislados. A continuación, presentamos un protocolo de recogida funcionales corazones / batiendo por disección manual de rápida a partir de embriones de pez cebra para obtener ARNm específico del corazón.

Abstract

El corazón embrionario de pez cebra se compone de sólo unos pocos cientos de células, lo que representa sólo una pequeña fracción de todo el embrión. Por lo tanto, para evitar que el transcriptoma cardiaca de ser enmascarada por el transcriptoma embrionario global, es necesario reunir un número suficiente de corazones para nuevos análisis. Además, como el desarrollo cardiaco pez cebra procede rápidamente, colección del corazón y los métodos de extracción de ARN tienen que ser rápida a fin de asegurar la homogeneidad de las muestras. A continuación, presentamos un protocolo rápido disección manual para recopilar funcionales corazones / golpeando a partir de embriones de pez cebra. Este es un requisito esencial para la posterior extracción de RNA específica del corazón para determinar los niveles de expresión de genes cardiacos específicos por análisis del transcriptoma, tales como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). El método se basa en propiedades adhesivas diferenciales del corazón embrionario de pez cebra en comparación con otros tejidos; esto permite la rápida physeparación de SICAL cardiaca a partir de tejido extracardíaca por una combinación de fuerza de cizallamiento de fluido interrupción, filtración por etapas y la recogida manual de los corazones transgénicos marcados con fluorescencia.

Introduction

El pez cebra (Danio rerio) es ampliamente utilizado en biología del desarrollo para estudiar la organogénesis in vivo debido a su desarrollo embrionario rápido, transparente y extrauterino, combinado con el pequeño tamaño y la disponibilidad de líneas reportero transgénicas con expresión específica de tejido de proteínas fluorescentes. Este pequeño vertebrado es especialmente adecuado para estudiar el desarrollo del corazón debido a la oxigenación de los primeros embriones de pez cebra no se basa en los latidos del corazón y el flujo sanguíneo; estas características han permitido la caracterización de un gran número de mutantes cardiovasculares 1,2 y el pez cebra es ahora un organismo modelo ampliamente reconocido para estudiar enfermedades del corazón 3.

Para el estudio de la expresión génica durante el desarrollo embrionario, las transcripciones son comúnmente analizados por todo el montaje hibridación in situ (DESEOS) 4, RT-qPCR 5, 6, microarrays o secuenciación de próxima generación (RNA-Seq) 7. MientrasDESEO permite un análisis espacio-temporal de la expresión génica dentro de todo el embrión, los niveles de transcripción suelen ser evaluada por RT-qPCR, microarrays o enfoques de RNA-Seq. Sin embargo, estos métodos requieren el enriquecimiento de tejido para perfiles de expresión génica específica.

Puesto que el corazón embrionario de pez cebra representa una pequeña fracción de todo el embrión, los estudios transcriptoma durante el desarrollo cardiaco requieren un protocolo para la disección y el enriquecimiento de los corazones. Además, para obtener datos fisiológicamente relevantes, es importante mantener el tejido cardíaco totalmente funcional hasta la extracción de ARN. Aquí se describe un protocolo para aislar rápidamente fisiológicamente normal y el corazón palpitante de cientos de embriones de pez cebra para obtener de manera eficiente las muestras de ARN de alta calidad para análisis posteriores. El presente método se basa en el protocolo reportado por Burns y MacRae, 2006 8. Para el enriquecimiento del tejido cardiaco, ambos métodos utilizan una línea reportero infarto transgénicoy tomar ventaja de las propiedades de adherencia diferencial de los corazones de embriones de pez cebra en comparación con otros tejidos. En pocas palabras, con la pipeta muchos embriones arriba y abajo a través de una punta de pipeta estrecho, corazones son liberados al mismo tiempo de los órganos embrionarios y posteriormente separados de escombros embrionaria en dos etapas de filtración rápida; entonces los corazones etiqueta fluorescente se ordenan de forma manual desde la basura y los recogen para su posterior procesamiento.

Protocol

Este protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de la ley alemana y el estado de Berlín; manejo del pez cebra fue supervisado por la autoridad local para la protección de animales (LaGeSo, Berlin-Brandenburg). 1. La obtención de embriones de pez cebra para el Corazón de Extracción Cross pez cebra reportero cardiaca tales como la Tg (myl7: EGFP) twu34 línea transgénica 9 con el fin de obtener embriones con la expresión específica de GF…

Representative Results

A continuación, describimos un representante experimento disección cardíaco usando el Tg pez cebra (myl7: GFP) twu34 línea transgénica 9, que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) exclusivamente dentro del miocardio (Fig. 1). Se recogieron tanto los corazones disecados y los embriones a partir de los cuales se derivaron para evaluar la pureza de la muestra del corazón. En pocas palabras, homocigotos Tg (myl7: GFP) pez cebra twu34 9 se outcrossed c…

Discussion

Este protocolo permite el rápido enriquecimiento de tejido del corazón embrionario de pez cebra para la expresión génica análisis. La cantidad y la calidad de la muestra específica cardiaca ARN depende en gran medida de unos pocos pasos cruciales: en primer lugar, la cantidad de la muestra se mejora en gran medida si la pérdida de corazones se impide a cada paso del protocolo, ya que la purificación del ARN sólo funcionará con suficiente material de partida. En segundo lugar, la pureza de la muestra, que depen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

Materials

Equipment for raising fish and collecting eggs  see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1,5ml centrifugation tubes
15ml and 50ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl  Santa Cruz sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) BD Biosciences 352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes  Prime 2302810
Egg water medium 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium  5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) Sigma-Aldrich A-5040 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium  Gibco 21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135
RNAlater Ambion AM7020
Trizol Ambion 1559606
Glycogen  Invitrogen 10814-010 20 µg/µL in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis

References

  1. Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
  2. Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
  3. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
  4. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
  5. Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
  6. Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology – enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
  7. Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
  8. Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
  9. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  11. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  12. Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
  13. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  14. Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
  15. Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
  16. Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
  17. Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
  18. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  19. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).

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Cite This Article
Lombardo, V. A., Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52087, doi:10.3791/52087 (2015).

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