전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부
Summary
제브라 피쉬의 심장 개발하는 동안 심장 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위해, 총 RNA는 고립 된 마음에서 추출해야합니다. 여기서 우리는 심장 별의 mRNA를 얻기 위해 제브라 피쉬 배아에서 빠른 설명서를 해부하여 기능 / 구타 마음을 수집하기위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
제브라 피쉬 배아 심장은 전체 배아의 작은 부분을 나타내는, 몇백 세포로 구성된다. 따라서, 글로벌 배아 사체에 의해 마스크되는 심장 사체를 방지하기 위해, 상기 분석 하트 충분한 수를 수집 할 필요가있다. 제브라 피쉬 심장 개발이 급속히 진행 더욱이, 심장 수집 및 RNA 추출 방법은 샘플의 균일 성을 확보하기 위해서는 신속한 있어야한다. 여기서 우리는 제브라 피쉬 배아에서 기능 / 꺾고 마음을 수집하기위한 빠른 매뉴얼 해부 프로토콜을 제시한다. 이것은 전 사체 분석에서는 이들 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (RT-qPCR에)와 같은 심장 특이 유전자 발현 수준을 결정하기 위해 후속 심장 특이 RNA 추출을위한 필수 조건이다. 방법은 다른 조직에 비해 제브라 피쉬 배아 심장의 접착 성 차이에 기초한다; 이것은 빠른 PHY 허용유체 전단력 중단, 단계적 여과 및 형질 전환 형광 표지 된 마음의 설명서 모음의 조합에 의해 심장 외 조직에서 심장의 이외에도 클래식 분리.
Introduction
제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio))는 널리 때문에 작은 크기와 형광 단백질의 조직 특이 적 발현과 유전자 변형 기자 라인의 가용성과 결합의 빠르고 투명하고 자궁 외 배아 발달로 생체 내에서 기관 형성을 연구하기 위해 발달 생물학에서 사용된다. 이 작은 척추 동물은 특히 초기 제브라 피쉬 배아의 산소가 심장 박동, 혈액 흐름에 의존하지 않기 때문에 심장 개발을 연구하기에 적합하다; 이러한 기능은 심장 혈관 돌연변이 1,2 많은 수의 특성을 허용하고 제브라 피쉬는 이제 심장 질환 (3) 연구 널리 알려진 모델 생물이다.
배아 개발하는 동안 유전자 발현을 연구하기 위해, 성적 증명서는 일반적으로 전체 마운트 현장 하이브리드에 (WISH) 4 분석, RT-qPCR에 5, 마이크로 어레이 (6), 또는 차세대 시퀀싱 (RNA-SEQ) 7. 동안WISH 전체 배아 내의 유전자 발현의 시공간적 분석, 전사 레벨은 일반적으로 RT-qPCR에, 마이크로 어레이 또는 RNA-SEQ 접근법에 의해 평가되어 있습니다. 그러나 이러한 방법은 특정 유전자 발현 프로파일 링에 대한 조직 농축이 필요합니다.
제브라 피쉬 배아 심장이 전체 배아의 작은 부분을 나타 내기 때문에, 심장 개발하는 동안 사체 연구는 해부과 마음의 농축을위한 프로토콜이 필요합니다. 또한, 생리 학적으로 관련 데이터를 얻기 위해, 그것은 RNA 추출까지 완전히 기능 심장 조직을 유지하는 것이 중요하다. 여기서 우리는 신속하게 생리 학적으로 정상 분리하고 효율적으로 추가 분석을위한 고품질의 RNA 샘플을 얻기 위해 제브라 피쉬 배아의 수백 마음을 구타하기위한 프로토콜을 설명합니다. 본 발명의 방법은 화상 및 맥레이 2006 년 8 의해보고 된 프로토콜을 기반으로합니다. 심장 조직의 농축의 경우, 두 가지 방법은 형질 전환 심근 기자 행을 사용하여및 다른 조직에 비해 제브라 피쉬 배아 마음의 차동 접착 특성을 활용. 간단히, 좁은 피펫 팁을 통해 아래로 많은 배아를 피펫으로, 마음이 동시에 배아의 몸에서 해제되고 순차적으로 두 개의 빠른 여과 단계에서 배아 파편 분리; 형광 표지 된 마음은 수동으로 남아있는 파편에서 분류 및 추가 처리를 위해 수집됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 유전자 발현 용 제브라 피쉬 배아 심장 조직의 신속한 분석을 보충한다. RNA 정제 할수있는 충분한 작동하기 때문에, 하트 손실 프로토콜의 모든 단계에서 방지 할 경우에는 먼저, 시료의 수량이 크게 향상된다 : 심장 특이 RNA 샘플의 양과 질을 크게 몇 결정적인 단계에 따라 출발 물질. 둘째, 실험에 전적으로 의존하는 샘플의 순도는, 정렬 및 엄격하게 다른 조직을 제외한 동안 배양…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.
Materials
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5ml centrifugation tubes | |||
| 15ml and 50ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µL in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
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