An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.
Оболочечных вирусов используют мембранные гликопротеины на их поверхности в качестве посредника вступление в клетках-хозяевах. Трехмерная структурный анализ этих гликопротеин шипов, часто технически сложным, но важным для понимания вирусной патогенез и в разработке лекарственных препаратов. Вот, протокол представлен для определения вирусной структуры шип с помощью компьютерного усреднения данных электронных крио-томографии. Электрон крио-томография является методом в электронной микроскопии используется для получения трехмерных томографических реконструкций громкости или томограммы, плеоморфных биологических образцов, таких как мембранные вирусов в ближайшем родной, замороженных гидратированных государства. Эти томограммы раскрыть структуры, представляющие интерес в трех измерениях, хотя и с низким разрешением. Вычислительная усреднение субобъемов, или суб-томограмм, необходимо получить более высокое разрешение деталь повторяя структурные мотивы, такие как вирусные шипами гликопротеинов. Подробное вычислительный подход для Алиgning и среднем суб-томограммы, используя программный пакет Jsubtomo изложена. Этот подход позволяет визуализировать структуры вирусных шипами гликопротеинов с разрешением в диапазоне 20-40 Å и изучения изучения высших порядков шип-до-шип взаимодействий на вириона мембраны. Типичные результаты представлены на вирус Bunyamwera, оболочечным вируса из семейства буньявирусов. Эта семья структурно разнообразная группа возбудителей, создающих угрозу для здоровья человека и животных.
Электрон крио-томография является методом визуализации электронно крио-микроскопии позволяет рассчитывать трехмерное (3D) реконструкции сложных биологических образцов. Подходящие образцы варьируются от очищенных макромолекулярных комплексов 1, нитей 2, покрытых пузырьков 3 и плеоморфных вирусов мембранных 4 до целых клетках прокариот 5 и даже тонких областях целых эукариотических клеток 6. После сбора данных о наклона серии, объемов 3D томографических, или томограмм, можно рассчитать, используя несколько установленных программных пакетов, в том числе Bsoft 7 и УПМ 8.
Два аспекта, присущие изучению биологических образцов с помощью электронного крио-томографии предела биологическая интерпретация соответствующих объемов томографических. Прежде всего, по причине ограниченного дозы электронов, которые могут быть применены к биологическим материалам перед введением значительного ущерба излучения, SignaL-к шуму в томографических данных, как правило, очень низка. Во-вторых, в результате геометрии наклона ограничен образца во время сбора данных, некоторые виды объекта остаются отсутствует, что приводит к так называемому отсутствует клина 'артефакта в объеме томографического. Тем не менее, оба этих ограничений могут быть преодолены, если объем томографическое содержит повторяющиеся идентичные структуры, такие как макромолекулярных комплексов, которые могут быть успешно усредненные 9-12.
До среднем структуры из томограмме реконструкций, объекты заинтересованности должны быть найдены и приведены в соответствие с той же ориентацией. Расположение таких структур может быть достигнута с использованием подхода, который часто называют шаблона согласования 13 по кросс-корреляции структуры шаблона в объеме томографического. Шаблон, используемый в этом процессе согласования могут быть получены из электронного крио-электронного микроскопа или крио-томографии в сочетании с 3D-реконструкции, или это может быть плотности карту моделируется сатомная структура. Несколько вычислительные пакеты были разработаны для выполнения этих задач 11.
Усреднение гликопротеинов шипов мембранных вирусов, таких как ВИЧ-1, был особенно успешным подходом для изучения их структуры 14-16. Понимание структуры является неотъемлемой для выявления как молекулярную основу вирус-хозяин взаимодействий и направляя развитие противовирусной и разработкой вакцин. В то время как кристаллографии макромолекул является методом выбора для высокого разрешения (как правило, лучше, чем 4 а) структурного анализа индивидуальных вирусных гликопротеинов и их комплексов, рентгеновские структуры, возникающие в результате этого метода белков, выделенных из природного мембранной среды на вириона . Таким образом, важные детали, такие как высшего архитектуру порядка вирусных гликопротеинов, в контексте вириона, по-прежнему отсутствует. С другой стороны, электрон крио-микроскопии и реконструкция одной частицыцелых оболочечных вирусов ограничивается вирионов с икосаэдрической симметрией 17,18. Электрон cryotomography сочетании с выравниванием суб-объема, таким образом, появились в качестве дополнительного метода, позволяющего изучение гликопротеинов шипов неправильной формы, плеоморфных вирусов в месте.
Мы разработали программное обеспечение с именем Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) для обнаружения, выравнивания и усреднения томографических субобъемов. Jsubtomo была использована в определении структуры ряда клеточных и вирусных структур 19-26. Здесь мы приводим подробный протокол, который позволяет определять вирусную-поверхностные шипованные структур. Чтобы обойти более-уточнение усредненных структур путем сопоставления шум, схема «золотым стандартом» уточнение принимается 10,27. Наконец, обсуждаются стратегии для визуализации и интерпретации типичных результатов.
Знание вирусной структуре гликопротеин спайка на вириона мембраны имеет важное значение для понимания репликации вируса и разработке терапевтических средств для лечения и профилактики инфекции. Электрон крио-микроскопии в сочетании с одной усреднения частиц стала самой используемой метод ее решения структуры оболочечных вирусных частиц, в том числе гликопротеина шипами. Однако этот способ ограничен icosahedrally симметричные вирусов. Здесь, за счет применения электронного крио-томографии и subtomogram усреднения в Jsubtomo, мы наметили общий протокол для определения гликопротеидных шипы на плеоморфными оболочечных вирусов, которые не поддаются другим текущим структурных методов биологии. Наши представительства результаты показывают, что разрешение этого метода является достаточной для выявления понимание архитектуры домена, олигомеризации, и вышестоящей организацией порядка гликопротеинов шипами на неповрежденных вирионов.
jove_content "> Наиболее важным шагом в этом протоколе строит два надежный запуск модели, которые являются статистически независимы друг от друга. Успешное выполнение этой стадии предполагает, что гликопротеин шипы являются достаточно большими, и не упакован друг против друга слишком плотно, так что отдельные пики могут быть визуально распознаваемых и вручную поднял в томограмм, и два независимых моделей в среднем. Если это не представляется возможным, две модификации протокола можно попытаться. первых, два независимых случайных модели могут быть построены, определив сначала два случайных подмножеств subtomograms а затем усреднения subtomograms в этих подмножествах 30. вторых, если структура изолированной шипа была получена с помощью других средств, например, с помощью рентгеновской кристаллографии, он может быть использован в качестве исходного модели. Тем не менее, следует соблюдать осторожность с низким Pass Filter эту модель с помощью отсечку низкого разрешения (50-70 А), как две результате моделей в следующем раунде изысканности волистатистически независимыми только за эту резолюцию. В связи с этой оговоркой первый подход рекомендуется.Получить разрешение от этого протокола зависит от четырех основных факторов: я. Стратегия сбора данных и качество входных данных, II. количество subtomograms, III. точность выравнивания из subtomograms, и IV. Неоднородность структуры. В то время как первая и вторая ограничение может быть в значительной степени преодолены с помощью высоких прямых детекторов сигнал-шум электронов в сочетании с ЦФК исправлены томографии и автоматизированного сбора данных, точность выравнивания дополнительно зависит от размера и формы самой структуре интерес. При применении данного протокола о малых шипами, не имеющих характерные особенности, это может быть выгодно, чтобы связать Fab фрагменты на шип для повышения точности выравнивания и, следовательно, разрешение 31. Наконец, если структуры, которые будут усредненные проявляют несколько конформации, суб-Томографыметоды классификации утра могут быть использованы в среднем различные конформации отдельно. С этой целью, Jsubtomo интегрируется с пакетом Динамо, предлагая мощный subtomogram классификацию 9.
Выше протокол является дополнением к рентгеновской кристаллографии изолированных вирусных гликопротеинов. Кристаллографических структур, могут быть установлены в суб-томограмме в среднем, чтобы получить точную ориентацию гликопротеина по отношению к мембране вириона. Применение этой методики, несомненно, будет продолжать, чтобы пролить свет на охватившего структуры вируса и патобиологии.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |