ממוצע של ויראלי מעטפת גליקופרוטאין Spikes מאלקטרוני Cryotomography שחזור באמצעות Jsubtomo
Summary
An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.
Abstract
וירוסים אפפו לנצל גליקופרוטאינים קרום על פני השטח שלהם לתווך כניסה לתאי מארח. ניתוח מבני תלת ממדי של "הקוצים" גליקופרוטאין אלה הוא לעתים קרובות מאתגר מבחינה טכנית אך חשוב להבנת הפתוגנזה נגיפית ובתכנון תרופות. הנה, פרוטוקול מוצג לקביעת מבנה ספייק נגיפית באמצעות מיצוע חישובית של נתונים cryo-טומוגרפיה של אלקטרון. cryo-טומוגרפיה של האלקטרון היא טכניקה במיקרוסקופ אלקטרונים המשמשת לחישוב שחזורים תלת ממדיים טומוגרפית נפח, או tomograms, של דגימות ביולוגיות pleomorphic כגון וירוסי קרום במצב כמעט טבעי, קפוא התייבשות. tomograms אלה לחשוף מבנים של עניין בשלושה ממדים, אם כי ברזולוציה נמוכה. מיצוע חישובית של כרכי משנה, או תת tomograms, יש צורך לקבל פירוט ברזולוציה גבוה יותר של חזרה על מוטיבים מבניים, כגון קוצים גליקופרוטאין ויראלי. גישה חישובית מפורטת לעלייgning וממוצע משנה tomograms באמצעות חבילת תוכנת Jsubtomo מתוארת. גישה זו מאפשרת הדמיה של המבנה של קוצים גליקופרוטאין נגיפיים לרזולוציה בטווח של 20-40 A ומחקר של חקר אינטראקציות מסדר גבוהות יותר ספייק לספייק על קרום virion. תוצאות אופייניות מוצגות לוירוס Bunyamwera, וירוס עטף מהמשפחה Bunyaviridae. משפחה זו היא קבוצה מבנית מגוונת של פתוגנים מהווים איום על בריאות אדם ובעלי חיים.
Introduction
cryo-טומוגרפיה של האלקטרון היא טכניקת הדמיה cryo-מיקרוסקופ אלקטרונים המאפשרת החישוב של שחזור תלת ממדים (3D) של דגימות ביולוגיות מורכבות. דגימות מתאימות נעות בין מתחמים מטוהרים macromolecular 1, חוטים 2, שלפוחית מצופה 3, ווירוסים קרום pleomorphic 4 לתאים פרוקריוטים כל 5 ואפילו אזורים דקים של תאים האיקריוטים כל 6. בעקבות איסוף הנתונים של הטיה סדרה, כרכי טומוגרפיה 3D, או tomograms, ניתן לחשב באמצעות מספר חבילות תוכנה שהוקמו, כולל 7 Bsoft וIMOD 8.
שני היבטים חלק מהלימוד של דגימות ביולוגיות על ידי גבול cryo-טומוגרפיה של אלקטרון הפרשנות הביולוגית של הכרכים טומוגרפית המקבילים. ראשית, בשל המינון המוגבל האלקטרון שיכול להיות מיושם על חומרים ביולוגיים לפני הצגת נזקי קרינה משמעותיות, signaיחסי ליטר לרעש בנתונים טומוגרפיה הם בדרך כלל נמוכים מאוד. שני, כתוצאה ממדגם מצומצם גיאומטריה הטיה במהלך איסוף הנתונים, כמה תצוגות של האובייקט להישאר נעדרו, שמוביל לחפץ שנקרא 'טריז חסר' בטומוגרפיה הנפח. עם זאת, שניהם של מגבלות אלה ניתן להתגבר אם טומוגרפיה הנפח מכיל חוזר על מבנים זהים, כגון מתחמי macromolecular, שיכול להיות בהצלחה בממוצע 9-12.
לפני ממוצע של מבנים משחזורי tomogram, אובייקטים של עניין יש למצוא ומיושרים לאותו הכיוון. איתור מבנים כאלה עשויים להיות מושגת על ידי מתאם צולב של מבנה תבנית בטומוגרפיה עוצמת הקול באמצעות גישה המכונה לעתים קרובות כתבנית תואמת 13. התבנית המשמשת בתהליך התאמה זה יכול לנבוע מהאלקטרון cryo-מיקרוסקופיה או cryo-טומוגרפיה של אלקטרון בשילוב עם שחזור 3D, או שזה יכול להיות מפת צפיפות מדומה ממבנה אטומי. כמה חבילות חישובית פותחו כדי לבצע משימות אלה 11.
ממוצע של קוצים גליקופרוטאין של וירוסי קרום, כגון HIV-1, הייתה גישה מוצלחת במיוחד לחקר המבנה שלהם 14-16. הבנה של המבנה היא חלק בלתי נפרד לחשיפת שני הבסיס המולקולרי של אינטראקציות-מארח וירוס ומנחה פיתוח עיצוב אנטי וחיסון. בעוד קריסטלוגרפיה macromolecular היא הטכניקה שבה נקטה ברזולוציה גבוהה (בדרך כלל טובה יותר מאשר 4 א) ניתוח מבני של גליקופרוטאינים נגיפיים בודדים והמתחמים שלהם, מבני רנטגן וכתוצאה משיטה זו הם של חלבונים מבודדים מהסביבה הטבעית הקרומית על virion . לפיכך, פרטים חשובים כגון ארכיטקטורה גבוהה יותר בסדר גודל של גליקופרוטאינים נגיפיים, בהקשר של virion, יישארו חסרים. מצד השני, אלקטרון cryo-מיקרוסקופיה ושחזור חלקיק בודדשל וירוסים עטופים כולו מוגבל לvirions עם הסימטריה icosahedral 17,18. cryotomography אלקטרונים בשילוב עם יישור משנה נפח וכך יצא כטכניקה משלימה המאפשרת המחקר של קוצים גליקופרוטאין של, וירוסי pleomorphic בצורה סדירה באתר.
פיתחנו תוכנה בשם Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) לצורך זיהוי, היישור, והמיצוע של כרכים תת טומוגרפית. Jsubtomo נוצל בקביעת המבנה של מספר המבנים התאיים ונגיפיים 19-26. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט, המאפשר למבני ספייק נגיפי-משטח הנחישות. כדי לעקוף את יתר העידון של מבנים בממוצע על ידי קישור בין רעש, ערכת העידון "תקן זהב" תאומץ 10,27. לבסוף, אסטרטגיות להדמיה ופרשנות של תוצאות אופייניות הם דנו.
Protocol
Representative Results
Discussion
ידע של מבנה ספייק גליקופרוטאין הנגיפי על קרום virion הוא חיוני להבנת שכפול נגיף ופיתוח תרופות לטיפול ולמניעת זיהום. cryo-מיקרוסקופ אלקטרונים בשילוב עם מיצוע חלקיק יחיד התפתח כשיטת המנוצלת ביותר כדי לפתור את המבנים של חלקיקי נגיף עטפו, כוללים הקוצים גליקופרוטאין. עם זאת, שיטה זו מוגבלת לicosahedrally וירוסים סימטריים. כאן, באמצעות היישום של אלקטרון cryo-טומוגרפיה ומיצוע subtomogram בJsubtomo, שהצגנו פרוטוקול כללי לקביעת קוצים גליקופרוטאין על pleomorphic עטף וירוסים שאינם ניתנים לשיטות ביולוגיה אחרות הנוכחיות מבניות. תוצאות הנציג שלנו מראות כי הרזולוציה של שיטה זו היא מספיק כדי לחשוף תובנות ארכיטקטורת תחום, oligomerization, וארגון מסדר גבוה יותר של קוצים גליקופרוטאין על virions שלמה.
jove_content "> השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא בניית שני מודלים התחלה אמינות שאינם תלויים מבחינה סטטיסטית זה מזה ביצוע. מוצלח של שלב זה מבוסס על ההנחה כי הקוצים גליקופרוטאין הם מספיק גדולים ולא עמוסים אחד נגד השני בחוזקה רבה מדי, כדי שקוצים בודדים יכול יוכר מבחינה ויזואלית וידני הרים בtomograms, ושני מודלים עצמאיים בממוצע. אם זה לא ריאלי, יכול להיות ניסו שני שינויים בפרוטוקול. ראשית, ניתן לבנות שני מודלים אקראיים עצמאיים על ידי ההגדרה ראשונה שתי תת קבוצות של subtomograms אקראיות ולאחר מכן ממוצע subtomograms בתוך תת אלה 30. שני, אם מבנה של ספייק המבודד כבר נגזר באמצעים אחרים, למשל על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן, ניתן להשתמש בו כמודל התחלה. עם זאת, יש להקפיד לנמוך תעבור סינון מודל זה באמצעות חתך ברזולוציה נמוכה (50-70 א), כשני מודלים וכתוצאה מכך בסיבוב הבא של עידון יהיהלהיות עצמאי מבחינה סטטיסטית רק מעבר להחלטה זו. בשל אזהרה זו, הגישה לשעבר מומלצת.הרזולוציה השגה מפרוטוקול זה תלוי בארבעה גורמים עיקריים: א. אסטרטגיה של איסוף נתונים והאיכות של נתוני הקלט, ii. מספר subtomograms, iii. דיוק יישור של subtomograms, וiv. ההטרוגניות של המבנים. בעוד המגבלה הראשונה ושנייה ניתן להתגבר במידה רבה על ידי שימוש בגלאים גבוהים אות לרעש ישירים אלקטרונים בשילוב עם CTF תיקן טומוגרפיה ואיסוף נתונים אוטומטי, דיוק היישור מושפע יותר על ידי הגודל וצורה של המבנה של העניין עצמו. בעת החלת פרוטוקול זה על קוצים קטנים חסרי מאפיינים בולטים, זה עשוי להיות יתרון לאגד שברי Fab לספייק כדי לשפר את דיוק היישור וכך החלטה ביום 31 ב. לבסוף, תצורות מרובות תערוכה אם המבנים להיות בממוצע, משנה tomogrשיטות סיווג בבוקר עשויות לשמש לממוצע תצורות שונות בנפרד. לשם כך, Jsubtomo משתלב עם חבילת דינמו, מציע subtomogram החזק סיווג 9.
הפרוטוקול לעיל הוא משלים לקריסטלוגרפיה רנטגן של גליקופרוטאינים נגיפיים מבודדים. יכולים להיות מצוידים מבנים קריסטלוגרפיים לממוצעים תת tomogram להשיג את הכיוון המדויק של גליקופרוטאין ביחס לקרום virion. יישום של מתודולוגיה זו, ללא ספק, ימשיך לשפוך אור על מבנה נגיף עטוף וpathobiology.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
References
- Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
- Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
- Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
- Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
- Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
- Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
- Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
- Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), 1010-1030 (2012).
- Briggs, J. A. G. Structural biology in situ–the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
- Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
- Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
- Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
- Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
- Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
- Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
- Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
- Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
- Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), 1396-1405 (1993).
- Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
- Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
- Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), 582-592 (2012).
