Jsubtomo kullanılarak Elektron Cryotomography Rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini Spikes ortalamasını
Summary
An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.
Abstract
Zarflı virüsler konakçı hücrelere giriş aracılık etmek ile ilgili yüzeyi üzerindeki zar glikoproteinleri kullanmaktadır. Bu glikoprotein 'sivri' Üç-boyutlu yapısal analizler çoğunlukla viral patogenezi anlamak için ve ilaç tasarımında teknik açıdan zor ama önemlidir. Burada, bir protokol elektron cryo-tomografi verileri hesaplama ortalamaya yoluyla viral başak yapı tayini için sunulmuştur. Elektron cryo tomografi bir doğala yakın, dondurulmuş sulu halde membran virüsler gibi biyolojik örneklerin pleomorfik, üç boyutlu hacimli tomografik rekonstrüksiyon veya tomografi, elde etmek için kullanılan elektron mikroskobu bir tekniktir. Bu tomografi düşük çözünürlükte olsa, üç boyutta ilgi yapılar ortaya çıkarmak. Alt birimlerine veya alt tomografi Hesaplamalı ortalama, viral glikoprotein sivri gibi yapısal motiflerini, tekrar eden yüksek çözünürlüklü detay elde etmek için gereklidir. Ali için ayrıntılı bir hesaplama yaklaşımıgning ve Jsubtomo yazılım paketi kullanarak, alt-tomogram ortalama özetlenmiştir. Bu yaklaşım, virion zar üzerinde yüksek seviyeli başak sivri uç etkileşimlerin bir çalışma 20-40 Â çözünürlük aralığında ve çalışma viral glikoprotein sivri yapısının görselleştirme sağlar. Tipik sonuçlar Bunyamwera virüsü, Bunyaviridae ailesinden zarflı virüs için sunulmuştur. Bu aile, insan ve hayvan sağlığı için bir tehdit patojenlerin yapısal olarak farklı bir gruptur.
Introduction
Elektron cryo-tomografi karmaşık biyolojik örneklerin bir üç boyutlu (3D) yeniden hesaplanmasını sağlayan bir elektron cryo-mikroskopi görüntüleme tekniğidir. Müsait örnekler bütün prokaryotik hücreler 5 ve bütün ökaryotik hücreler 6 bile ince alanlara saflaştırılmış makro-moleküler kompleksler 1, filaman 2, kaplamalı veziküller 3 ve pleomorfik membran virüs 4 arasında değişir. Bir tilt-dizi, 3D tomografik hacimleri, ya tomogramları veri toplama ardından, Bsoft 7 ve imod 8 olmak üzere birkaç kurulan yazılım paketleri kullanılarak hesaplanabilir.
Elektron cryo-tomografi sınırı gelen tomografik hacimlerinin biyolojik yorumlanması biyolojik örneklerin çalışmaya doğasında iki yönü. Bağlı olarak büyük radyasyon hasarı verilmesinden önce, biyolojik malzemelerden uygulanabilir sınırlı elektron doz signa, İlktomografi veri L-gürültü oranları tipik olarak çok düşüktür. İkinci olarak, veri toplama sırasında kısıtlı örnek eğim geometrisinin bir sonucu olarak, nesnenin bazı incelemeler tomografik hacimde bir sözde 'eksik kama' artefakt yol mevcut kalır. Tomografik birim halinde başarılı olarak 9-12 ortalama böyle makromoleküler kompleksler olarak özdeş yapılar, tekrar içerir, ancak, bu dezavantajların her ikisi de aşılabilir.
Tomogram rekonstrüksiyonlarda gelen yapıları ortalama önce, ilgi nesneler bulundu ve aynı yönde hizalanmış olmalıdır. Bu tür yapıları yerlerinin çoğu zaman, şablon olarak 13 eşleşen anılan bir yaklaşım kullanarak tomografik hacminde bir şablon yapının çapraz korelasyon elde edilebilir. Bu eşleştirme işleminde kullanılan şablon elektron cryo-mikroskobu veya 3D rekonstrüksiyon ile birlikte elektron cryo-tomografi elde edilebilir, ya da gelen simüle bir yoğunluk haritası olabilirBir atom yapısı. Birkaç bilgisayar paketler 11, bu görevleri yerine getirmek üzere geliştirilmiştir.
HIV-1 gibi membran virüsler, glikoprotein sivri ortalama, onların yapısını 14-16 çalışmak için özellikle başarılı bir yaklaşım olmuştur. Yapının, virüs konakçı etkileşimleri hem de moleküler temeli ortaya çıkartılması ve anti-viral ve aşı tasarımının gelişimi yönlendirmek için ayrılmaz bir parçasıdır. Makromoleküler glikoproteinler kristalografi ayrı ayrı virütik ve komplekslerin yapı analizine (4, bir zaman daha iyi) yüksek çözünürlüklü için tercih edilen bir tekniktir, ancak bu yöntemle elde edilen X-ışını yapısı, viryonun üzerindeki doğal ortamdan izole membran proteinleri vardır . Bu durumda, bu virion bağlamında viral glikoproteinlerin daha yüksek dereceli mimari, önemli bilgileri, eksik kalır. Öte yandan, elektron mikroskobu ve kriyo-tek parçacık yenidenbütün kılıflı virüsler ikosahedral simetri 17,18 ile virionlann sınırlandırılmıştır. Alt ses uyumu ile birlikte elektron cryotomography böylece yerinde düzensiz şekilli, pleomorfik virüslerin glikoprotein sivri çalışma izin tamamlayıcı bir teknik olarak ortaya çıkmıştır.
Biz Jsubtomo tomografik alt birimlerin tespiti, hizalama ve ortalama için (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) adında bir yazılım geliştirdik. Jsubtomo hücresel ve viral yapının 19-26 bir dizi yapı belirlemelerinde kullanılmıştır. Burada, biz belirlenmesi viral yüzey başak yapıları sağlayan ayrıntılı bir protokol, anahat. Gürültü ilişkilendirerek aşırı arıtma ortalama yapıların aşmak için, 'altın standart' arıtma şeması 10,27 benimsenmiştir. Son olarak, görselleştirme ve tipik sonuçların yorumlanması için stratejiler tartışılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viryon membran viral glikoprotein başak yapısının ortaya çıkarılmasıyla, virüs kopyalanmasını anlamak ve tedavi etmek ve enfeksiyonu önlemek için terapötik maddelerin geliştirilmesi için esastır. Tek bir parçacık ortalama ile bir araya Elektron mikroskobu kriyo-glikoprotein dahil olmak üzere sivri zarflı virüs partiküllerinin, yapılarını çözmek için en çok kullanılan yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem, simetrik virüsleri icosahedrally sınırlıdır. Burada, Jsubtomo elektron cryo-tomografi ve subtomogram ortalamanın uygulaması ile, biz pleomorfik diğer mevcut yapısal biyoloji yöntemleri uygun değildir virüsleri glikoprotein sivri zarflı belirlenmesi için genel bir protokol ana hatlarıyla. Bizim için temsili sonuçlar, bu yöntemin çözünürlüğü etki mimari, oligomerizasyonu ve sağlam viryonları üzerindeki glikoprotein sivri yüksek dereceli kuruluşa bakış açısı ortaya çıkarmak için yeterli olduğunu göstermektedir.
jove_content "> Bu protokol çerçevesinde en kritik adım, bu aşamada başka. Başarılı yürütme glikoprotein kramponları, böylece yeterince büyük ve çok sıkı birbirlerine karşı değil dolu olduğunu varsayar birinden istatistiksel olarak bağımsız iki güvenilir bir başlangıç modelleri oluşturmak bireysel sivri yapabilirsiniz görsel tanınan ve el tomogramları toplanmış ve iki bağımsız modelleri ortalaması alınmalıdır., bu mümkün değilse, protokol iki değişiklik teşebbüs edilebilir. Birincisi, iki bağımsız random modeller sonra ilk subtomograms rastgele iki alt kümelerini tanımlama ve inşa edilebilir Bu alt-gruplar içinde 30 subtomograms ortalama. İkinci olarak, izole edilmiş bir sivri yapı, X-ışını kristalografisi ile, örneğin başka yollarla elde edilmiş olsa bile, bu başlangıç modeli olarak kullanılabilir. Ancak, bakım, düşük alınmalıdır arıtmanın bir sonraki turda olacak iki sonuçlanan modelleri gibi, düşük çözünürlüklü cut-off (50-70 Å) kullanarak filtreyi Bu modeli geçmekSadece bu çözünürlükte ötesinde istatistiksel bağımsız olması. Bu ihtar nedeniyle, eski yaklaşım tavsiye edilir.Bu protokol elde çözünürlük, dört ana faktöre bağlıdır: i. veri toplama stratejisi ve girdi verilerinin kalitesi, ii. subtomograms sayısı, III. hizalama subtomograms doğruluğu ve iv. yapıların heterojen. Birinci ve ikinci sınırlama, büyük ölçüde yüksek sinyal-gürültü doğrudan elektron CTF ile kombine dedektörleri tomografi giderilmiştir ve otomatik veri toplanmasını kullanılarak aşılabilir birlikte, hizalama hassasiyeti daha da ilgi kendisinin yapısının boyutu ve şekli etkilenir. Belirgin özellikleri göstermeyen küçük sivri bu protokolü uygulanır, bu hizalama doğruluk ve böylece çözünürlüğü arttırmak için 31 sivri Fab fragmanlarını bağlamak için avantajlı olabilir. Son olarak, bu yapılar için ortalama halinde sergi çoklu biçimlerde, alt-tomam sınıflandırma yöntemi ayrıca farklı konformasyonlara ortalama için kullanılabilir. Bu amaçla, Jsubtomo güçlü subtomogram sınıflandırma 9 sunan, Dinamo paketi ile bütünleştirir.
Yukarıdaki protokol izole edilmiş viral glikoproteinler de, X-ışını kristalografisi tamamlayıcıdır. Kristalografik yapılar viryon zanna göre glikoproteinin Tam bir yönlendirme elde etmek için alt-tomogram ortalamalar içine monte edilebilir. Bu metodolojinin uygulama şüphesiz zarflı virüs yapısında ve patobiyolojisi üzerine ışık tutmaya devam edecektir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
References
- Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
- Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
- Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
- Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
- Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
- Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
- Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
- Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), 1010-1030 (2012).
- Briggs, J. A. G. Structural biology in situ–the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
- Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
- Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
- Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
- Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
- Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
- Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
- Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
- Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
- Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), 1396-1405 (1993).
- Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
- Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
- Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), 582-592 (2012).
