Summary

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

Published: April 03, 2014
doi:

Summary

Burada tarif edilen protokol modifiye nükleosit trifosfat yol açan karmaşık güzergah yolunda çok sayıda engeller açıklamak ve kesintiye uğratmak için amaçlamaktadır. Dolayısıyla, bu protokol bu aktive bina bloklarının sentezini ve pratik uygulamalar için onların durumu hem de kolaylaştırır.

Abstract

Bir kimyasal fonksiyonelliğin getirilmesi için geleneksel bir strateji olgunlaşmamış zincirine uygun şekilde modifiye edilmiş fosforamidit öncüleri eklenmesi ile katı-faz sentezi kullanılmasıdır. Ancak, oldukça kısa dizilere sentezi ve sınırlama sırasında kullanılan koşullar, bu yöntemin uygulanabilirliğinin engellemektedir. Öte yandan, modifiye edilmiş nükleosit trifosfatlar nükleik asitler, pratik bir uygulama geniş palette modifiye nükleik asitlerin kullanımı için bir yol açıyor bir strateji içine çok sayıda işlevsel grupların sokulması için hafif kullanılmıştır yapı taşları aktive edilir Böyle ribozimlerin ve DNAzimler fonksiyonel etiketleme ve nesil gibi. En önemli sorunlardan biri, bu nükleosid analoglarının izolasyonu ve karakterizasyonu yol açan metodoloji karışıklık bulunur.

Bu ekran yazıda, thes sentezi için detaylı bir protokol mevcute fosfor (III) bazlı reaktifler kullanılarak değiştirilmiş analoglarıdır. Buna ek olarak, onların biyokimyasal karakterizasyonu için prosedür astar uzatma reaksiyonları ve TdT kuyruklanmasız polimerizasyon özel bir vurgu ile, ifşa edilir. Bu ayrıntılı protokol modifiye dNTP işçiliği ve kimyasal biyolojide bunların daha sonraki kullanım için faydalı olacaktır.

Introduction

5'-nükleosit trifosfatlar ((d) NTP'ler) evrensel enerji birimi olmaktan hücre metabolizması düzenleyicileri kadar sayısız işlem ve fonksiyonların katılan önemli bir biyomoleküllerin bir sınıfını temsil eder. Bu temel biyolojik dönüşümler rollerine ilave olarak, bunların modifiye edilmiş oligonükleotidlerin muadilleri olarak işlevsel grupların sokulması için bir çok yönlü ve hafif bir platform, güzel bir şekilde, genellikle 1,2 uygulandığı bir otomasyonlu katı faz sentezini tamamlar bir yöntem olarak gelişmiş var. Gerçekten de, (d) NTP'ler RNA ve DNA polimerazların 3 alt-tabakalar için, amino asitler 4-13, boronik asitler 14,15, nornbornene 16, diamondoid benzeri kalıntıları 17 için, yan zincirler de dahil olmak üzere işlevsel grupların zenginliği olarak hareket edebilir Resim organik kataliz 18, safra asitleri 19 ve hatta 20 oligonükleotidler oligonükleotid içine sokulabilir.

_content "> nükleik asitlerin işlevsellik için uygun bir vektör temsil ötesinde, modifiye edilmiş dNTP, SELEX ve modifiye katalitik nükleik asit 21-30 ve çeşitli pratik uygulamalar için 10 aptamers oluşturulması için in vitro seçimi diğer ilgili kombinasyon yöntemlerinde meşgul olabilir 31-36. modifiye edilmiş dNTP'ler polimerizasyonu tarafından ortaya olan ilave Yan zincirler, bir seçim deney sırasında incelenmiş ve nükleik asitlerin 37'nin oldukça kötü fonksiyonel cephanelik takviye edilebilir kimyasal alanını artırmak düşünülmektedir. Ancak, bu rağmen çekici özellikleri ve sentetik ve analitik yöntemlerin her ikisi de gelişmesinde yapılan son ilerlemeler, evrensel uygulanabilir ve yüksek verimli bir prosedür modifiye nükleosit trifosfat 2,38 işçiliği ihtiyaç vardır.

Bu mevcut protokolün amacı, (bazen) karmaşık prosedürleri önde gelen t içine ışık tutmaktıro sentezi ve bu aktive edilmiş yapı blokları (Şekil 1 B) biyokimyasal karakterizasyonu. Özel vurgu genellikle bulmak zor ya da deneysel bölümlerde bulunmadığına ancak saf (d) NTP'ler izolasyonu (Şekil 1) yol açan sentetik yolunun başarılı bir şekilde tamamlanması için henüz çok önemli olan tüm sentetik ayrıntılar verilecektir.

Protocol

1.. Modifiye nükleosit trifosfatın sentezi Seçilen sentetik yaklaşım bu yöntem genellikle güvenilir ve çok az yan ürünlerin (Şekil 1A) 39 yol açar beri Ludwig ve Eckstein tarafından geliştirilen prosedürü takip eder. Iki defa, susuz piridin (2 mi) ile ve daha sonra gece boyunca vakum altında kuru olarak uygun 3'-OAc-korumalı nükleositi (genellikle 0.1 mmol) Coevaporate. Aynı zamanda, bir gece boyunca vakum altında kuru tributila…

Representative Results

Bu nükleik asitler 41 içine işlevsel grupların bir çok dizi kolay sokulması için izin verirse, modifiye nükleosit trifosfatlar sentetik hedefleri çekici edilir. Bununla birlikte, bu aktif yapı bloklarının izolasyonu ve karakterizasyonu genellikle zor olduğu ortaya çıkar. Sonuç olarak, bu tarifnamede gösterilen sonuçlar, belirtilen sentetik ve biyokimyasal işlemler (Şekil 1 B) içinde çeşitli adımları için bir yardım el sağlamak düşünülmektedir. <p class="jov…

Discussion

Nükleik asitlerin içine modifikasyonların dahil antisense ve antijen maddelerin geliştirilmesi 42,43, etiketleme ve oligonükleotidlerin 41 fonksiyonel etiketleme de dahil olmak üzere pek çok pratik uygulamalar için ilgi çekici olan ve genetik alfabe 44-46 genişletmek çabalarında. Kimyasal değişiklikler ve fonksiyonel gruplar genellikle, standart ve otomatik katı faz sentezi protokolleri uygulanmasıyla nükleik asitler dahil edilir. Bununla birlikte, fosforamidit yapı ta?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (Hibeler n PZ00P2_126430 / 1 ° ve PZ00P2_144595) tarafından desteklenmiştir. Prof C. Leumann minnetle laboratuvar alanı ve ekipman sağlayarak, hem de onun sürekli destek için için kabul edilmektedir. Bayan Sue Knecht verimli tartışmalar için kabul edilmektedir.

Materials

tributylammonium pyrophosphate  Sigma Aldrich P8533 Hygroscopic solid, keep under Ar
2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  Sigma Aldrich 324124 Moisture sensitive
Pyridine Sigma Aldrich 82704 Under molecular sieves
Dioxane Sigma Aldrich 296309 Under molecular sieves
dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich 40248 Under molecular sieves
Acetonitrile  Fisher Scientific HPLC grade
Triethylamine Sigma Aldrich 90342
Tributylamine Sigma Aldrich 90781
ddH2O Milli-Q deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich 159220
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-25
Biochemical reagents
g-[32P]-ATP Hartmann Analytics FP-301
Natural dNTPs Promega U1420
Vent (exo) DNA polymerase NEB M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB MO210S
9°Nm DNA polymerase NEB MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Promega M828A
Pwo DNA polymerase Peqlab 01 01 5010
T4 PNK Thermo Scientific EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) Serva 10679.01
Agarose Apollo Scientific BIA1177
G10 Sephadex Sigma G10120
Urea Apollo Scientific BIU4110
Equipment
Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å) Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler Bioconcept BYQ6042E
PCR vials Bioconcept 3220-00
HPLC system Amersham Pharmacia Biotech Äkta basic 10/100
Oligonucleotides
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.

References

  1. Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
  2. Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates – Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
  3. Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2′-Modified Ribonucleoside 5′-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
  4. Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2′-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
  5. Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
  6. Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
  7. Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
  8. Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
  9. Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
  10. Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
  11. Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
  12. Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
  13. Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
  14. Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
  15. Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
  16. Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
  17. Biomol Chem, O. r. g. . 9, 7482-7490 (2011).
  18. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
  19. Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
  20. Baccaro, A., Steck, A. -. L., Marx, A. . Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
  21. Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
  22. Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
  23. Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
  24. Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
  25. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
  26. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
  27. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
  28. Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
  29. Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
  30. Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
  31. Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
  32. Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2′-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
  33. Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
  34. Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
  35. Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
  36. Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
  37. Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
  38. Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
  39. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5′-0-(1-thiotriphosphates), 5′-triphosphates and 2′,3′-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
  40. Williams, D. M., Harris, V. H., Murphy, J. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. 9, 237-275 .
  41. Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
  42. Kurreck, J. Antisense technologies – Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
  43. Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
  44. Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
  45. Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
  46. Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
  47. Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
  48. Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
  49. Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
  50. Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
  51. Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3′-end protection using 2′,4′-bridged nucleoside-5′-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
  52. Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
  53. Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).

Play Video

Cite This Article
Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates – From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).

View Video