Nucleosídeos Trisfosfatos - Da síntese à Caracterização Bioquímica
Summary
O protocolo aqui descrito visa explicar e resumir os numerosos obstáculos no caminho da rota intrincada levando a trifosfatos de nucleosídeos modificados. Consequentemente, este protocolo facilita tanto a síntese desses blocos de construção ativados e sua disponibilidade para aplicações práticas.
Abstract
A estratégia tradicional para a introdução de funcionalidades químicas é a utilização de síntese em fase sólida, anexando precursores fosforamideto adequadamente modificados para a cadeia nascente. No entanto, nas condições utilizadas durante a sintese e a restrição de sequências curtas em vez dificultar a aplicabilidade desta metodologia. Por outro lado, trifosfatos de nucleósidos modificados são activados os blocos de construção que têm sido empregues para a introdução suave de numerosos grupos funcionais nos ácidos nucleicos, uma estratégia que abre o caminho para a utilização de ácidos nucleicos modificados numa paleta ampla de aplicações práticas como marcação funcional e geração de ribozimas e DNAzymes. Um dos maiores desafios reside na complexidade da metodologia conduz ao isolamento e caracterização destes análogos de nucleósidos.
Neste artigo de vídeo, que apresentam um protocolo detalhado para a síntese de these análogos modificados utilizando reagentes baseados em fósforo (III). Além disso, o procedimento para a sua caracterização bioquímica é divulgada, com uma ênfase especial em reações de extensão de primers e polimerização tailing TdT. Este protocolo detalhado será de uso para a elaboração de dNTPs modificados e seu posterior uso em biologia química.
Introduction
Trifosfato 5'-nucleosídeos ((d) PNT) representam uma classe de biomoléculas vitais que estão envolvidos em inúmeros processos e funções que vão desde a ser a moeda universal de energia para os reguladores do metabolismo celular. Em adição ao seu papel nestas transformações biológicas fundamentais, os seus homólogos modificados têm avançado como uma plataforma versátil e leve para a introdução de grupos funcionais em oligonucleótidos, uma metodologia bem que complementa a síntese em fase sólida automatizada, que é normalmente aplicada 1,2. De fato, desde que os (d) PNT pode atuar como substratos para RNA e DNA polimerases 3, uma grande variedade de grupos funcionais, incluindo aminoácidos 4-13, ácidos borónico 14,15, nornbornene 16, resíduos diamantóides-17, como cadeias laterais de organocatálise 18, ácidos biliares, e até 19 oligonucleótidos 20 pode ser introduzido em oligonucleótidos.
_content "> Além de representar um vetor conveniente para a funcionalização de ácidos nucleicos, dNTPs modificados podem ser envolvidos em SELEX e outros métodos combinatórios relacionados de seleção in vitro para a geração de ácidos nucleicos catalíticos modificados 21-30 e aptâmeros para diversas aplicações práticas 10, 31-36. As cadeias laterais adicionais que são introduzidos através da polimerização dos dNTP modificados são pensados para aumentar o espaço químico que pode ser explorada durante uma experiência de selecção e completar o arsenal funcional bastante pobre de ácidos nucleicos 37. No entanto, apesar destas características atraentes e os recentes progressos realizados no desenvolvimento de ambos sintéticos e métodos analíticos, universalmente aplicável e os procedimentos de alto rendimento existe para a elaboração de trifosfatos de nucleosídeos modificados 2,38.O objetivo do presente protocolo é o de lançar luz sobre a (às vezes) os procedimentos intrincados líder to a síntese e caracterização bioquímica destes blocos de construção activadas (Figura 1B). Especial ênfase será dada em todos os detalhes sintéticos que muitas vezes são difíceis de encontrar ou estão ausentes nas seções experimentais, mas são ainda fundamentais para a conclusão bem sucedida da via sintética levando ao isolamento de pura (d) PNT (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
A inclusão de modificações nos ácidos nucléicos é de interesse para inúmeras aplicações práticas, incluindo o desenvolvimento de agentes anti-senso e antigène 42,43, rotulagem e etiquetagem funcional de oligonucleotídeos 41, e em esforços para expandir o alfabeto genético 44-46. Alterações químicas e grupos funcionais são geralmente introduzidas em ácidos nucleicos por aplicação de protocolos de síntese em fase sólida padrão e automatizadas. No entanto, os blocos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação Swiss National Science (Grants n ° PZ00P2_126430 / 1 e PZ00P2_144595). Prof C. Leumann é reconhecido agradecimento por fornecer o espaço e equipamentos de laboratório, bem como pelo seu apoio constante. Ms. Sue Knecht é reconhecido por discussões frutíferas.
Materials
| tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| Biochemical reagents | |||
| g-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo–) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Equipment | |||
| Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| Oligonucleotides | |||
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1 | |||
| 5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1 | |||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: | |||
| Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330 | |||
| Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F. |
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