Summary

Isolatie van CA1 Nuclear verrijkte fracties van hippocampus Slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van Synapto-nucleaire Messenger Eiwitten

Published: August 10, 2014
doi:

Summary

We geven een gedetailleerd protocol voor inductie van lange termijn potentiëring van de CA1 regio van de hippocampus en de daaropvolgende isolatie van nucleaire verrijkte fracties uit de tetanized gebied van het segment. Deze benadering kan worden gebruikt om activiteit te bepalen afhankelijk kerneiwit invoer cellulaire modellen van leren en geheugen.

Abstract

Bestuderen activiteit afhankelijke eiwitexpressie subcellulaire translocatie of fosforylering essentieel om de onderliggende cellulaire mechanismen van synaptische plasticiteit begrijpen. Lange termijn potentiëring (LTP) en lange termijn depressie (LTD) geïnduceerde acute hippocampale plakken worden algemeen aanvaard als cellulaire modellen van leren en geheugen. Er zijn tal van studies die live cell imaging of immunohistochemie benaderingen gebruiken om de activiteit afhankelijk eiwit dynamiek te visualiseren. Echter deze werkwijzen afhankelijk van de geschiktheid van antilichamen voor immunocytochemie of overexpressie van fluorescentie-gemerkte eiwitten in enkele neuronen. Immunoblotting van eiwitten is een alternatieve methode voor het verstrekken van onafhankelijke bevestiging van de bevindingen. De eerste bepalende factor voor de bereiding van subcellulaire fracties individueel tetanized hippocampale plakken is de lage hoeveelheid materiaal. Ten tweede, de behandeling procedure is cruciaal omdat zelfs zeer korte en kleine manipulaties living plakjes zou activering van bepaalde signaleringscascades induceren. Hier beschrijven we een optimale workflow om voldoende hoeveelheid nucleaire verrijkte fractie van voldoende zuiverheid te verkrijgen van de CA1 regio acute hippocampale plakjes van rattenhersenen. Als een representatief voorbeeld wordt aangetoond dat de ERK1 / 2 gefosforyleerde vorm van het synapto-kerneiwit messenger Jacob actief naar de kern na inductie van LTP en kan worden gedetecteerd in nucleaire verrijkte fractie uit CA1 neuronen.

Introduction

Synaptic N-methyl-D-aspartaat-receptoren (NMDARs) spelen een cruciale rol in synaptische plasticiteit en celoverleving signaleren dat activatie van extrasynaptic NMDARs kan leiden neurodegeneratie en celsterfte. Deze veranderingen hangen af van streng gecontroleerde / gereglementeerde activiteit afhankelijke genexpressie en dus vereisen constante communicatie tussen geactiveerde synapsen of dendrieten en de kern 7. De MAP kinases ERK1 / 2 zijn effectoren van synaptische NMDARs signalering en zijn betrokken bij NMDAR-activatie-geïnduceerde genexpressie, dat signalering via extrasynaptic NMDAR geen of een remmend effect op de ERK1 / 2 activiteit 8,11.

Er zijn een aantal eiwitten die zijn aangetoond shuttle tussen distale dendrieten en de nucleus. Veel van deze eiwitten een nucleair lokalisatiesignaal en actief aan de kern 6,9 getransporteerd langs microtubuli in een dynein en importin afhankelijke wijze. Interestingly, sommige boodschappers alleen worden doorgevoerd naar de kern in reactie op specifieke synaptische stimuli. Bijvoorbeeld wordt retrograde transport van cyclisch AMP respons element bindend eiwit 2 (CREB2) geïnduceerd door chemische LTD maar niet LTP 12. Gelokaliseerde NMDAR synaptische stimulatie drijft-CREB gereguleerde transcriptie coactivator (CRTC1) in de kern, een translocatie proces, dat betrokken is bij de lange termijn hippocampale plasticiteit 4. Recent werd aangetoond dat het eiwit boodschapper Jacob naar de kern nadat beide, synaptische en extrasynaptic NMDAR activatie en regelt CREB afhankelijke gentranscriptie 5. De synaptische of extrasynaptic oorsprong van het signaal gecodeerd in een posttranslationele modificatie van Jacob. Synaptische activiteit induceert ERK1 / 2 afhankelijke fosforylatie van Jacob in een cruciale serine op positie 180 (pJacobS 180) dat een voorwaarde voor de daaropvolgende translocatie naar de kern van primaire hippocampale kweek. Bovendien in CA1 neuronen van acute hippocampus plakjes pJacobS 180 naar de kern na Schaffer onderpand LTP maar niet LTD 1,10. pS180 Jacob leidt tot een verhoogde expressie van plasticiteit gerelateerde genen en deze genexpressie terugvoert synaptische functie. In scherp contrast, Jakob die naar de kern na extrasynaptic NMDARs activering niet is gefosforyleerd op Ser180 en kan worden geassocieerd met verschillende eiwit complex in de kern veroorzaken "CREB uitgeschakeld en een retractie van synaptische contacten 10.

De meeste gepubliceerde studies over de nucleaire import van synapto-nucleaire eiwit boodschapper zijn gedaan in gedissocieerde neuronale primaire culturen. Daarom zou het interessant zijn om te zien of dergelijke bevindingen kunnen worden gereproduceerd in fysiologisch relevante omstandigheden met behulp van de hippocampus plakjes waar neuronale connectiviteit en functie zijn veel beter bewaard gebleven. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor de beoordeling van LTP-deaanhangende nucleaire translocatie van eiwitten boodschappers door immunoblotting. Deze methode is ook geschikt voor het analyseren van activiteit afhankelijke fosforylering van proteïnen in een ruw nucleaire fractie. Specifiek, het huidige protocol omvat de voorbereiding van acute CA1 hippocampus plakjes, inductie, en de opname van LTP. Vervolgens wordt CA1 regio microscopisch ontleed om de gestimuleerde gebied isoleren. Wij gecombineerd en bewerkt het protocol voor nucleaire isolatie door CellLytic nucleaire Extraction Kit met veranderingen die door Zhao en collega's 17. De geoptimaliseerde procedure omvat de lysis van ontleed CA1 regio hypotone buffer waardoor cel zwelling en afgifte van kernen. Cell lysis en kernen morfologie kan worden bepaald door microscopisch onderzoek. Nuclear verrijking bereikt door een korte centrifugatie stap. Immunoblotting analyse met antilichamen tegen NeuN en NSE2 specifieke merkers van nucleaire of cytosolische fracties, geeft aan dat deze benadering kan worden gebruikt als een snelleen reproduceerbare protocol deze subcellulaire fracties te isoleren en zeer labiele posttranslationele modificaties zoals eiwitfosforylatie bestuderen. Bovendien is deze werkwijze voordelig voor kleine weefselmonsters afkomstig van ontleed CA1 regio van hippocampale plakjes en kan worden gebruikt in combinatie met immunohistochemie van hippocampale plakjes.

Protocol

1 Voorbereiding van de Acute hippocampus Slices van volwassen hersenen van de rat Verdoven van ratten met isofluraan. LET OP: Voer de procedure met behulp van een gesloten exicator, niet inhaleren isofluraan. Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd. Onthoofden de rat, isoleert de hersenen, en dompel in gecarboniseerd (95% O 2/5% CO2 gasmengsel) ijskoude Gey-oplossing (samenstelling in mM: 130 NaCl, 4,9 KCI, 1,5 CaCl2 · 2H 2 O 0,3 MgSO4 · 2H 2</su…

Representative Results

We hebben eerder aangetoond dat de synapto-kerneiwit messenger Jacob accumuleert in de kern na de inductie van LTP maar niet LTD 1. Bovendien translocatie van Jacob na synaptische stimulatie vereist activatie van MAPK ERK1 / 2 en fosforylering van Jacob op Ser180 (figuur 1). Gefosforyleerd Jacob naar de kern in een importin-afhankelijke wijze en de gefosforyleerde toestand kan worden bewaard gedurende langere tijd door associatie met de intermediaire filament αinternexin 15 <stron…

Discussion

De stappen in het hierboven beschreven protocol een leidraad hoe voor te bereiden hippocampus acute gesneden uit jonge of volwassen ratten, opwekken en opnemen LTP, snel ontleden gestimuleerde gebied van slice, en voor te bereiden nucleaire verrijkte fractie voor activiteit afhankelijk eiwit dynamiek te bestuderen. Deze benadering is afgeleid van een combinatie van verschillende methoden onafhankelijk van elkaar gebruikt. We geoptimaliseerde workflow en bieden voldoende gedetailleerd voor de beginner om het opzetten van…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.

Materials

Table 1. Equipment
CED 1401 AD/DA converter Cambridge Electronics Design, UK
Axopatch 200B amplifier Axon,USA
Axon Digidata acquisition system Axon,USA
Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software Axon,USA
Leica microscope Leica TCS SP2,Germany
P-97 Standard microelectrode puller Sutter,USA
Stereomicroscope Leica Leica S4E, Germany
Vibrotome Leica VT1000S, Germany
Isolated pulse stimulator Model2100, A-M systmes, USA
Centrifuge Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17
SDS-PAGE system BIORAD
Cooler JULABO
Bright field Microscope NIKON ECLIPSE TS100
Cell culture incubator Thermo Electron Corporation, HERAEUS
Micromanipulator Luigs & Neumann, SM-5, Germany
Blotting chamber and electric power supplier Hoefer Scientific Instruments, San Francisco
Cooler Julabo, F12
Centrifuge Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17
Submerged type Recording Chamber custom made
U-shape and submerged type incubator  custom made
Small surgical scissors
Scalpel
Thin spatula
Plastic Pasteur pipette
Plastic culture dish 
Bunsen beaker
Syringe
Table 2. Reagents
Name of Reagent Company Catalog Number Comments/Description
NaCl ROTH Art.-Nr.3957.1 ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO
KCl ROTH Art.-Nr.6781.1 ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO
CaCl2·2H2O MERCK 1.02382.0500 pro analysi
MgSO4·2H2O MERCK 5886.05 pro analysi
MgCl2·6H2O AppliChem CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 for Molecularbiology
KH2PO4 MERCK 12034.025 for Molecularbiology
Na2HPO4·2H2O MERCK 1.06574.1000 extra pure
Glucose·H2O ROTH Art.-Nr.6887.1 for Molecularbiology
Hepes ROTH Art.-Nr.9105.4 PUFFERAN, ≥99.5%, p.a.
NaHCO3 MERCK 1.06329.1000 pro analysi
Protease inhibitor Coctail ROCHE
Phosphostop ROCHE
Bicuculline Tocris bioscience
 Isofluran Baxter
Table 4. Antibodies
Primary antibodies Company Catalog Number Species
pJac-s180 Biogenes/ purified rabbit (dil. 1:100)
NeuN Milipore MAB377 mouse (dil. 1:1,000)
NSE Cell Signaling D20H2 rabbit (dil. 1:1,000)
beta-actin Sigma A-5441 mouse (dil. 1:5,000)
Secondary antibodies Species
IgG HRP Conjugated DAKO goat anti – mouse (1:5,000)
IgG HRP Conjugated NEB goat anti – rabbit (1:5,000)

References

  1. Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
  2. Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. 신경과학. 169 (4), 1520-1526 (2010).
  3. Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
  4. Ch’ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O’Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
  5. Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
  6. Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again–communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
  7. Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
  8. Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
  9. Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
  10. Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
  11. Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
  12. Lai, K. O., Zhao, Y., Ch’ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
  13. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
  14. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. 신경과학. 131 (3), 601-610 (2005).
  15. Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
  16. Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
  17. Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).

Play Video

Cite This Article
Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins. J. Vis. Exp. (90), e51310, doi:10.3791/51310 (2014).

View Video