Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) is een gevestigde diermodel voor multiple sclerose. C57BL / 6 muizen worden geïmmuniseerd met myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), wat resulteert in een oplopende zwakke verlamming veroorzaakt door autoreactieve immuuncellen in het centrale zenuwstelsel. Protocollen voor de ziekte van inductie en toezicht zal worden besproken.
Multiple sclerose is een chronische neuro-inflammatoire demyeliniserende aandoening van het centrale zenuwstelsel met een sterke neurodegeneratieve component. Hoewel de exacte etiologie van de ziekte is nog niet duidelijk zijn autoreactieve T-lymfocyten gedacht dat een centrale rol spelen in de pathofysiologie. MS therapie is slechts gedeeltelijk effectief zo ver en onderzoeksinspanningen blijven onze kennis over de pathofysiologie van de ziekte uit te breiden en nieuwe behandelingsstrategieën te ontwikkelen. Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) is de meest voorkomende diermodel voor MS delen vele klinische en pathofysiologische kenmerken. Er is een grote verscheidenheid van EAE modellen die verschillende klinische, histologische en immunologische aspecten van menselijke MS weerspiegelen. Actief-geïnduceerde EAE in muizen is de makkelijkste induceerbare model met robuuste en reproduceerbare resultaten. Het is vooral geschikt voor het onderzoeken van de effecten van drugs of van bepaalde genen met behulp van transgene muizen uitgedaagd door auto neuroinflammation. Daarom worden muizen geïmmuniseerd met homogenaten CZS of peptiden van myeline-eiwitten. Vanwege de lage immunogene potentieel van deze peptiden worden sterke adjuvantia gebruikt. EAE gevoeligheid en fenotype afhankelijk van het gekozen antigeen en knaagdieren stam. C57BL / 6 muizen zijn de meest gebruikte soort voor transgene muis bouw en reageren onder andere op myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG). De immunogene epitoop MOG 35-55 gesuspendeerd in compleet Freund's adjuvans (CFA) vóór immunisatie en pertussis toxine wordt op de dag van immunisering en twee dagen later. Muizen ontwikkelen een "klassieke" self-limiting monofasisch EAE met oplopende slappe verlamming binnen 9-14 dagen na immunisatie. Muizen worden dagelijks geëvalueerd met behulp van een klinisch scoresysteem voor 25-50 dagen. Speciale aandachtspunten voor de zorg onttrekken van dieren met EAE evenals potentiële toepassingen en beperkingen van dit model worden besproken.
Multiple sclerose (MS) is een chronische demyeliniserende ontstekingsziekte van het centrale zenuwstelsel waarbij de vernietiging van oligodendrocyten en neuronen resulteert in heterogene en opslaan van klinische symptomen. MS wordt beschouwd als een prototype auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) en dierlijke modellen ontwikkeld om licht te werpen op de complexe pathogenese. Bovendien, de huidige therapieën zijn slechts gedeeltelijk effectief en doel voornamelijk de inflammatoire fase van de ziekte, terwijl de neurodegeneratieve component is waarschijnlijk de grootste uitdaging voor toekomstige therapeutische benaderingen 1,2.
Hoewel de exacte etiologie van de ziekte is nog onduidelijk is een auto-immuunreactie tegen epitopen op de myelineschede van de neuronen van het CZS verondersteld om het begin van de ziekte veroorzaken. Ontregeling van het immuunsysteem, genetische kwetsbaarheid en omgevingsfactoren (zoals infecties, vitamine D) worden verondersteldinvloed centrale aspecten van de pathofysiologische mechanismen van MS.
Drie verschillende types van dierlijke modellen worden momenteel vastgesteld voor de exploratie van pathologische patronen van MS: Virale modellen zoals Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV), modellen veroorzaakt door giftige stoffen zoals cuprizone, en tenslotte verschillende varianten van experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) 3, 4. Hoewel ze allemaal na te bootsen kenmerken van MS, ze verschillen enorm in de onderliggende pathologische functies, zoals de betrokkenheid van het adaptieve immuunsysteem. EAE is de meest voorkomende diermodel als het bijzonder nuttig om neuro wegen onderzoeken en vaak dient als een "proof-of-principle" model voor de effectiviteit van nieuwe behandelingsstrategieën 5,6. EAE geïnduceerd kan worden in vele verschillende dieren (bijv. muizen, ratten, miniswine, cavia's, kippen of primaten). Echter, de meest muizen gebruiken soort die ten minste deels wordenaan de uitbreiding van het repertoire van geavanceerde transgene of knockout muizen 7.
De pathofysiologie van EAE is gebaseerd op de reactie van het immuunsysteem tegen hersen-specifieke antigenen. Deze reactie induceert ontsteking en vernietiging van het antigeen dragende structuren, waardoor neurologische en pathologische kenmerken die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in patiënten met MS. Drie verschillende benaderingen kunnen worden onderscheiden: Actief geïnduceerde EAE (aeae; actieve immunisatie), passief overgedragen EAE (peae, overdracht van encefalitogene cellen van een geïmmuniseerd dier), en meer recent spontane EAE muismodellen (SEAE) die de studie van auto mogelijk mechanismen zonder exogene manipulatie. De makkelijkste induceerbare model is aeae bij muizen waardoor in snelle en robuuste resultaten. Dit model wordt beschouwd als de "gouden standaard" van neuro dierlijke modellen van veel onderzoekers op het gebied 8.
Voor aeae inductie, het diergeïmmuniseerd met een subcutane injectie van een emulsie bestaande uit de gekozen antigeen en compleet Freund's adjuvans (CFA) vergezeld van een intraperitoneale injectie van pertussis toxine op de dag van immunisering en twee dagen later. Bijgevolg worden myeline-specifieke T lymfocyten geactiveerd in de periferie en migreren in het CZS over de bloed-hersen-barrière. Bij binnenkomst in het CZS, worden T-cellen geactiveerd door lokale en infiltreren antigeen-presenterende cellen resulteert in de daaropvolgende inflammatoire cascades, betrokkenheid van andere cellen, zoals monocyten of macrofagen en uiteindelijk in demyelinisatie en axonale celdood 9. Afhankelijk van de immunisatie protocol en verzameling muizenstam (bijv. C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) en antigeen (bijvoorbeeld myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG), myeline basisch eiwit (MBP), proteolipide myeline-eiwit (PLP)), de ziekte Natuurlijk kan een acute, chronische progressieve of relapsing remitting ziekte cursus.
<p class= "Jove_content"> C57BL / 6 muizen hebben de meest gebruikte soort voor transgene muizen constructie geworden en een groeiende schare van knockout of transgene muizen beschikbaar is. We beschrijven hier een protocol voor immunisatie van C57BL / 6 muizen met MOG 35-55 peptide 10 waardoor een monofasische EAE eerst symptomen na 9-14 dagen, maximaal ziekte ongeveer 3-5 dagen na ziektebegin en traag en gedeeltelijk herstel symptoom in de komende 10-20 dagen. Aangezien het immunogene potentieel van MOG 35-55 peptide alleen is niet voldoende om ziekte te induceren, adjuvantia zoals CFA noodzakelijk. Aangenomen wordt, dat de componenten van CFA activeren mononucleaire fagocyten induceren van de fagocytose van deze moleculen en secretie van cytokinen. Dit resulteert in de verlenging van de aanwezigheid van antigenen en een efficiënter transport daarvan aan het lymfestelsel. EAE inductie wordt vergemakkelijkt door toepassing van pertussis-toxine (PT), die onder meer is heeft voorgesteld om te modulerende bloed-hersenbarrière en de immunologische responsiviteit zelf 11. Na ziekte inductie, moet speciale zorg worden genomen voor de dagelijkse evaluatie van muizen voor ziektesymptomen.Een veelvoud van verschillende EAE modellen met actieve immunisatie protocollen is beschreven in de afgelopen decennia. Terwijl de rat modellen zijn op grote schaal gebruikt tot voor kort, muizen zijn nu de meest populaire modelorganisme voor EAE onderzoek. Deze ontwikkeling is onder andere door de grote en steeds toenemende repertoire beschikbare transgene muizen. Immunisatie van C57BL / 6 muizen met MOG 35-55 peptide is een van de wijdst verspreide EAE modellen en kan worden beschouwd als een betrouwbare, reproduceerbare en goed te gebruiken diermodel. In veel neuroimmunologische laboratoria wordt de MOG 35-55 geïnduceerde EAE opgericht als het model van keuze, terwijl andere EAE modellen worden gebruikt voor meer specifieke experimentele vragen.
Een kritisch punt van overweging is de planning van de experimentele instellingen om ervoor te zorgen dat de EAE experimenten worden uitgevoerd methodologisch correct. Voor de interne validiteit, wordt verblind scoren van ziektesymptomen sterk aanbevolen. Experimental groepen moeten zijn leeftijd, gewicht en geslacht gematchte en muizen moeten willekeurig worden toegewezen aan behandelingsgroepen. Experimenten moeten altijd worden uitgevoerd in overeenstemming met het dierenwelzijn regelgeving. EAE studies zijn vaak underpowered en geen rekening houden met statistische type II fouten. Daarom vóór experimenten steekproefgrootte worden uitgevoerd. Noodzakelijke groepsgrootte afhankelijk van de verwachte grootte effect. Raadpleging van een deskundige voor statistische analyse zou voordat EAE experimenten worden beschouwd.
Een aantal beperkingen van het protocol moet in gedachten worden gehouden. Het belangrijkste is interpretatie van aeae gegevens gecompromitteerd door de wijze van immunisatie met het gebruik van adjuvans en pertussis toxine, welke aanvullende invloed op de immunologische reactie. Ook moet worden overwogen dat de MOG 35-55 EAE model toont vooral een CD4 + T-cel gedreven immunologische respons. CD8 + T-cellen en B-cellen speleneen minder prominente rol en alternatieve protocollen moeten worden overwogen bij het aanpakken van deze celtypen. De verwachte koers ziekte is acuut, monofasisch en zelf-beperkt. Alternatief kan een recidieve ziekte uiteraard ook verwezenlijkt in alternatieve EAE modellen. Een andere belangrijke beperking van het protocol is een zekere voorkeur voor de immunologische component van de MS pathofysiologie. Gedurende de laatste jaren is het steeds duidelijker dat MS heeft een sterke neurodegeneratieve component geworden. De dood van oligodendrocyten en neuronen resulteert in een progressieve accumulatie van neurologische tekorten. Er moet rekening mee worden gehouden dat de EAE model niet volledig geschikt zijn om experiment vragen over neurodegeneratieve mechanismen van auto-ontsteking pakken. Alternatieve diermodellen met een focus op CNS pathologie kan worden beschouwd – zoals de cuprizone model dat giftige demyelination compromissen zonder betrokkenheid van het perifere immuunsysteem.
De beschreven protocol worden beschouwd als een basis neuro experimenteel model en kunnen worden aangepast voor andere toepassingen. De hierboven beschreven experimentele procedure kan gemakkelijk worden toegepast op andere protocollen EAE door het variëren muizen stammen of de soort en hoeveelheid eiwit (bv gebruiken PLP 139-151 peptide en SJL muizen een relapsing remitting EAE ziekteverloop die is bijzonder geschikt voor het beoordelen van therapeutische effecten op recidieven). De beschreven protocol kan ook gebruikt worden voor adoptieve transfer experimenten (passieve EAE). In dit model worden C57BL / 6 muizen geïmmuniseerd met MOG 35-55 peptide en CFA zoals hierboven beschreven. Daarentegen wordt pertussis toxine niet vereist. Na 7-15 dagen, milt of lymfeknopen geïsoleerd en immuuncellen in vitro opnieuw gestimuleerd met MOG 35-55 peptide en diverse cytokinen vóór de overdracht in een nieuwe groep C57BL/6se muizen. Deze ontvanger muizen een paar dagen eerder dan na clas ontwikkelen EAESical immunisatie. In vitro omstandigheden kan worden gevarieerd voor specifieke immunologische vragen (bijv. polarisatie in T H 1 of T H 17 cellen).
Soms kan lage incidentie van de ziekte of zwakke symptomen een experimentele uitdaging. Een aantal aanbevelingen voor het oplossen van problemen zijn:
– Ernst van de ziekte kan worden gevarieerd met verschillende hoeveelheden peptide / muis.
– Optimale CFA concentratie kan variëren van 1-5 mg / ml. Overweeg een titratie van CFA bij het vaststellen van de experimenten. Verwijzen wij u naar de betreffende richtlijnen van de respectieve institutionele Animal Care en gebruik Comite voor toegestane CFA concentraties zo veel regels verbieden CFA concentraties van meer dan 2 mg / ml.
– Verschillende methoden worden beschreven voor het bereiden van de emulsie. Alternatieve methoden zoals vortexen gedurende 1 uur of sonicatie kan worden beschouwd als slechte emulgering wordt beschouwd als possible fout bron.
– Leeftijd, geslacht, seizoen van het jaar en milieuomstandigheden in het dier faciliteit zijn belangrijke factoren die EAE gevoeligheid beïnvloeden. Er moet voor worden gezorgd dat de omstandigheden vergelijkbaar zijn tussen onafhankelijke experimenten.
Zoals hierboven beschreven, kan het genoemde protocol worden gebruikt als uitgangspunt voor adoptieve EAE experimenten. Dit model is vooral geschikt voor het scheiden van perifere en centrale zenuwstelsel werkt een genetische fenotype (bijv. door overdracht encefalitogene knockout cellen in wildtype ontvangende muizen) en specifieke immunologische vragen het fenotype van de overgedragen cellen grondig gekarakteriseerd. De nieuwste ontwikkeling in EAE onderzoek gedurende de afgelopen jaren zijn T-cel-receptor transgene muizen. Deze muizen ontwikkelen EAE symptomen spontaan zonder invloed van buitenaf te omzeilen het probleem van adjuvante inenting. Echter, dit model vereist grote hoeveelheden dieren breeding tot voldoende groepsgrootte verzekeren. Evaluatie van knockout muizen vereist kruisen voor EAE experimenten in tegenstelling tot aeae. Aangezien elke muis ontwikkelt ziektesymptomen op een andere dag, kan evaluatie van nieuwe stoffen nogal ingewikkeld. Daarom is de waarde van klassieke aeae voor neuro-inflammatoire steeds onaangetast.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Münster (SEED 12/3, SB).
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight | e.g. Jackson Laboratory, Charles River | ||
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) | e.g. Pepceuticals Ltd | Store at -20°C | |
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Sigma-Aldrich Co. | F5506 | Store at 4 °C. |
Syringes, 1 ml with 26G3/8 needle | e.g. Becton Dickinson & Co. | 309625 | |
Syringes, 2 ml | e.g. B. Braun | 7389 | |
Needles, 25G5/8 and 30G1/2 | e.g. Becton Dickinson & Co., | 305122, 305106 | |
Three way halve | e.g. B. Braun | 16494 C | |
Pertussis toxin, lyophilized in buffer | Enzo Life Sciences Inc. | BML-G100 | Store at 4 °C. |
M. tuberculosis H37 RA | BD Difco | 231141 | Store at 4 °C. |