髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG<sub> 35-55</sub>）诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的C57BL / 6小鼠
Summary
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化的一个建立的动物模型。 C57BL / 6小鼠用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）肽35-55（MOG 35-55），因此所造成的自身反应性免疫细胞，在中枢神经系统中的上行弛缓性麻痹。协议对疾病的诱导和监控将被讨论。
Abstract
多发性硬化是一种中枢神经系统具有强大的神经变性成分的慢性神经炎症性脱髓鞘性疾病。而该疾病的确切病因还不清楚，自身反应性T淋巴细胞被认为在它的病理生理中发挥核心作用。 MS的治疗只是部分有效，至目前为止的研究工作继续扩大我们对疾病的病理生理学知识，并开发新的治疗策略。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是最常见的动物模型中的MS共享许多临床和病理特征。有EAE模型反映人类的MS不同临床，免疫学和组织学方面的广泛多样性。在小鼠积极诱导EAE是具有强大的和可复制的结果最容易诱发模型。它特别适用于通过使用由自身免疫性neuroi质疑转基因小鼠研究中特定基因的药物或效果nflammation。因此，小鼠用CNS组织匀浆或髓鞘蛋白的肽。由于这些肽的低免疫原性的潜力，强佐剂的使用。 EAE的易感性和表型取决于所选择的抗原和啮齿动物品系。 C57BL / 6小鼠是最常用的应变为转基因小鼠和施工等等响应髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）。免疫原性表位的MOG 35-55在完全弗氏佐剂（CFA）免疫前和百日咳毒素被暂停施加在免疫的当天和两天后。小鼠制定了“经典”自限性的单相EAE与内免疫接种后9-14天升弛缓性瘫痪。鼠标使用的是临床评分系统25-50天每天进行评估。特别考虑照顾回吐动物与EAE以及这种模式的应用潜力和局限性进行了讨论。
Introduction
多发性硬化（MS）是一种中枢神经系统的慢性脱髓鞘性疾病，其特征在于少突胶质细胞和神经元的结果在异种和积累临床症状的破坏。 MS被认为是中枢神经系统（CNS）的原型自身免疫性疾病和动物模型已经发展阐明其发病机制复杂的光。此外，目前的治疗仅部分有效和靶向主要疾病的炎症阶段，而神经变性成分可能是为将来的治疗的重大挑战方法1,2。
而该疾病的确切病因还不清楚，针对表位在CNS中的神经轴突的髓鞘自身免疫反应被假定惹病的发作。免疫系统，遗传脆弱性和环境因素（ 如感染，维生素D）的调节异常被认为MS的病理生理机制的影响主要方面。
三种不同类型的动物模型中对于MS的病理类型的探索正在建立的病毒：病毒模型像泰勒鼠脑脊髓炎病毒（TMEV），诱导的中毒性剂，如cuprizone模型，最后不同的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）3的变体， 4。虽然他们都模仿MS的功能，它们在潜在的病理特性，如适应性免疫系统的参与大大不同。 EAE是最常见的动物模型，因为它是非常有用的调查神经炎途径和经常作为“验证性原则”的模式为新的治疗策略，5,6的疗效。 EAE可诱发许多不同的动物（ 如小鼠，大鼠，miniswine，豚鼠，鸡，或灵长类动物）。然而，小鼠已成为最广泛使用的品种，其至少部分原因是由于扩大复杂的转基因或基因敲除小鼠7剧目。
EAE的病理生理学是基于免疫系统的抗脑特异性抗原反应。这种反应引起的炎症抗原携带结构和破坏，导致神经系统相媲美，病理特点，那些在MS患者中观察到。三种不同的方法可分为：积极诱导的EAE（AEAE;主动免疫），被动转移的EAE（pEAE;从免疫动物转移脑炎细胞），以及最近的自发的EAE小鼠模型（SEAE），允许自体免疫的研究机制没有外源性操纵。最简单的诱导模型是AEAE小鼠产生快速而稳定的结果。这种模式被认为是神经免疫动物模型的许多研究人员在外地8的“金标准”。
对于AEAE感应，动物被免疫的皮下注射由所选择的抗原乳剂和完全弗氏adjuvans（CFA）伴有腹膜内注射百日咳毒素免疫的当天和两天后。因此，髓鞘特异的T淋巴细胞在激活的外周及进入中枢神经系统迁移穿过血 – 脑屏障。在进入中枢神经系统，T细胞通过产生随后的炎性级联反应，其他细胞如单核细胞或巨噬细胞，并最终在脱髓鞘和轴突的细胞死亡9参与本地和浸润性抗原呈递细胞的活化。根据不同的免疫方案和小鼠品系的组合（ 例如 C57BL / 6，SJL / J Biozzi）和抗原（ 如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG），髓磷脂碱性蛋白（MBP），髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）），所述疾病当然可以采取一种急性，慢性进行性或复发缓解病程。
<p class="“jove_content”"> C57BL / 6小鼠已成为最常用的应变为转基因小鼠建设和不断增长的多种基因敲除或转基因小鼠中的是可用的。我们在这里描述的协议的C57BL / 6小鼠的MOG 35-55肽10，它产生一个单相的EAE与后9-14天，最大疾病发病和慢和局部症状恢复后约3-5天第一个症状免疫在未来的10-20天。作为单独的MOG 35-55肽的免疫原性潜力不足以诱发疾病，佐剂如CFA是必要的。据推测，这CFA的部件激活单核吞噬细胞诱导这些分子的吞噬作用和细胞因子的分泌。这将导致在抗原的存在以及它们的更有效的传输到淋巴系统的延长。 EAE诱导是通过应用程序百日咳毒素（PT）的已（其中包括）被建议来调节方便血-脑屏障和免疫应答本身11。后诱发疾病，特别必须注意的老鼠疾病症状的日常考核。Protocol
Representative Results
Discussion
多种不同的EAE模型与主动免疫的协议已被描述在过去的几十年。虽然大鼠模型已被广泛使用，直到最近，老鼠是现在最流行的模式生物EAE研究工作。这种发展是其中包括由于现有的转基因小鼠的广阔和不断增长的剧目。 C57BL / 6小鼠用MOG 35-55肽免疫是分布最广的EAE模型之一，可以被视为一个可靠的，可复制和良好使用的动物模型。在许多神经免疫实验室，MOG 35-55诱导的EAE被确立为首选的模式，而其他的EAE模型被用于更具体的实验问题。
需要考虑的一个关键点是实验设置的规划，以确保EAE的实验方法上进行正确的。对于内部效度，疾病症状蒙蔽得分，强烈推荐。 EXPERimental群体应该是年龄，体重和性别匹配和鼠标应该随机分配到治疗组。实验中应始终遵循动物福利法规的规定执行。 EAE的研究往往动力不足，不考虑统计II型错误。因此，之前的实验中，样本量的计算应该被执行。必需基团的大小取决于预期的效果大小。专家进行统计分析的咨询会开始EAE的实验前，应考虑。
该协议的一些局限性需要牢记。最重要的是，AEAE数据解释是由免疫使用的佐剂和百日咳毒素具有对免疫反应两个额外的影响力的模式受到损害。还应当认为，MOG 35-55 EAE模型，主要显示了CD4 + T细胞驱动的免疫应答。 CD8 + T细胞和B细胞中发挥一个不太起眼的角色和替代方案应解决这些细胞类型时，应考虑。预计病程为急性，单相和自限性。可替换地，复发 – 缓解疾病过程也可以在替代的EAE模型来实现。该协议的另外一个重要的限制是一定的偏差朝向MS病理生理的免疫成分。在过去几年里，它已成为越来越明显，微软有很强的神经退行性组件。少突胶质细胞和神经元的结果在神经功能缺损的渐进积累的死亡。必须考虑到，在EAE模型可能不完全适合于处理有关的自身免疫性炎症的神经退行性机制的实验问题。重点是中枢神经系统的病理替代的动物模型可以被认为- 如 cuprizone模型，危及有毒脱髓鞘无外周免疫系统的参与。
所描述的协议被认为是一个基本的神经免疫实验模型，并且可以被修改为其它的应用程序。上文所述的实验步骤，可通过改变小鼠株很容易地应用到其他的EAE协议或类型和蛋白质的量（ 例如，使用PLP 139-151肽和SJL小鼠的复发-缓解EAE疾病过程是特别适合用于评估治疗对复发的影响）。所描述的协议也可用于过继转移实验（被动EAE）。在这个模型中，C57BL / 6小鼠用MOG 35-55肽和如上所述CFA。与此相反，不要求百日咳毒素。后7-15天，脾或淋巴结中分离和免疫细胞再刺激在体外用MOG 35-55肽和各种细胞因子转移到C57BL/6se小鼠的新组之前。这些受体小鼠EAE的发展早于在CLAS几天SICAL免疫。 在体外条件下可以改变的特异性免疫问题（ 例如偏振成T H 1和T H 17细胞）。
有时候，低发病率或弱的症状可能是一个实验性的挑战。故障排除有些建议是：
– 疾病严重程度可以改变不同量的肽/鼠标。
– 最优CFA浓度可以从1-5毫克/毫升的不同而不同。考虑终审法院确立滴定实验时。请参阅相应的机构动物护理和使用委员会的终审法院容许浓度的各准则尽可能多的法规禁止的终审法院浓度超过2毫克/毫升。
– 不同的方法被描述用于制备乳液。如果乳化不佳被认为是possib替代方法，如涡旋1小时或超声可以考虑乐误差源。
– 年龄，性别，年份和动物设施内环境条件的季节是影响EAE的易感性的重要因素。它应当确保条件与独立实验之间。
如上所述，所提到的协议可以作为起点继EAE实验。该模型尤其适合用于分离基因的表型（ 如通过转印脑炎敲除细胞分化成野生型受体小鼠）的外周和中枢神经系统的影响，并为特定的免疫学问题，作为转移细胞的表型能充分进行表征。在EAE的研究在过去几年的最新发展，是T细胞受体的转基因小鼠。这些小鼠EAE的发展自发症状无外界影响规避佐剂接种的问题。然而，这种模式需要大量动物进行breedi纳克以确保有足够规模的团体。评价基因敲除小鼠的杂交育种，需要事先对EAE实验对比AEAE。为每只小鼠发展在不同的一天疾病症状，新颖的物质的评价可以是相当复杂的。因此，古典AEAE的神经免疫的价值仍然受到质疑。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由跨学科临床研究中心（IZKF）明斯特（种子03/12，SB）的支持。
Materials
| Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight | e.g. Jackson Laboratory, Charles River | ||
| MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) | e.g. Pepceuticals Ltd | Store at -20°C | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Sigma-Aldrich Co. | F5506 | Store at 4 °C. |
| Syringes, 1 ml with 26G3/8 needle | e.g. Becton Dickinson & Co. | 309625 | |
| Syringes, 2 ml | e.g. B. Braun | 7389 | |
| Needles, 25G5/8 and 30G1/2 | e.g. Becton Dickinson & Co., | 305122, 305106 | |
| Three way halve | e.g. B. Braun | 16494 C | |
| Pertussis toxin, lyophilized in buffer | Enzo Life Sciences Inc. | BML-G100 | Store at 4 °C. |
| M. tuberculosis H37 RA | BD Difco | 231141 | Store at 4 °C. |
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