Summary

Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

Published: March 02, 2014
doi:

Summary

İnsan Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) ve Epstein-Barr virüsü (EBV) ile yakından ilgili olan bir model herpesvirüs, kemirgen gamma herpes virüsü 68 HV68) ile enfekte olan fareler içindeki antiviral sitokin üretimini ölçmek için bir protokolü tarif eder. Genetik olarak modifiye edilmiş olan fare soyları ve fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) kullanarak, biz antiviral sitokin üretimini in vivo ve ex vivo hem de değerlendirildi. Lentiviral transdüksiyonu ile nakavt embriyonik fibroblastlar içinde doğal bağışıklık bileşenlerinin ifade "yeniden kurgulamak", daha fazla belirli doğuştan gelen bağışıklık moleküllerin kesin ve diferansiyel antiviral sitokin üretimini düzenler, anahtar sinyal olayları incelemek.

Abstract

Bir viral enfeksiyona yanıt olarak, ana doğuştan gelen bağışıklık tepkisi antiviral sitokin gen ekspresyonu ve üretimi düzenlemek kadar aktive edilir. Tersine, virüsler hayatta kalma ve çoğalma için konakçı bağışıklık sinyalizasyon kaçmasına ve sömürmek için karmaşık stratejiler gelişmiştir. Viral bağışıklık kaçırma, konak savunması ve viral kaçırma gerektiren, ev sahibi-virüs etkileşimi ayırt etmek en büyüleyici ve dinamik arayüzler biri sağlar. Bu çalışmalar doğal bağışıklık düzenlenmesinde anlayışımızı ilerletmek ve yeni antiviral tedaviler geliştirmek için yol açmıştı.

Murin γHV68 murin kemirgenler doğal bir patojendir. Farelerin γHV68 enfeksiyonu in vivo virüs-host etkileşimleri pertürbasyon geçerli değildir ki insan KSHV ve EBV antiviral yanıt incelemek için izlenebilir küçük bir hayvan modeli sağlar. Burada antiviral sitokin üretimini belirlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol, diğer vir uyarlanabilirkullanır ve sinyal yolları.

Son zamanlarda, γHV68 NFKB aktivasyonu ve antiviral sitokin üretimini ortadan kaldırmak için, mavs ve IKKβ, sitosolik Rig-I ve MDA5 alt akışında önemli bir doğuştan gelen bağışıklık sinyal bileşenleri ele geçirilmesini keşfettiler. Özellikle, γHV68 enfeksiyon IKKβ aktif hale gelir ve bu aktive IKKβ RelA bozulma hızlandırmak için ilişki fosforile eder. Bu nedenle, etkili bir anti-viral γ HV68 sitokin gen ekspresyonunu negating akış yukarı aktive IKKβ ikinci NFKB aktivasyon birbirinden ayrılacak. Bu çalışma memba bağışıklık aktivasyonu hemen aşağı transkripsiyonel aktivasyonu geçersiz ve antiviral sitokin üretimini kaçmasına viral patojen tarafından yakalanan sayede karmaşık bir strateji açığa kavuşturmaktadır.

Introduction

Son çalışmalar konak doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını montaj genel sinyal kaskadlarını hatlarıyla. Ayrı bölmeleri içinde ikamet eden, örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) 1 sinyalizasyon doğuştan bağışıklık tetiklemek için farklı kökenli patojen ilişkili moleküler şekilleri (PAMPs) algılar. Retinoik asit-indüklenmiş gen I (Rig-I) ve melanoma farklılaşma antigen 5 (MDA5) proteinlerinin spesifik yapısal 2 RNA türlerinin, sitosolik sensörleridir. Aktivasyonu üzerine, Rig-I sırayla, aynı zamanda Ikki olarak bilinen IKK (IKKαβγ) ve IKK-ilişkili kinaz (TBK1 ve IKKε, aktive eder, adaptör (ayrıca IPS-1, VISA ve Cardif olarak da bilinir) alt Mavs ile etkileşime ) 3-6 kompleksleri. Aktif Doğuştan gelen bağışıklık kinazlar, transkripsiyon faktörlerinin ve bunların önleyicileri dahil olmak üzere, gen ekspresyonunun önemli regülatörleri, fosforile ve konakçı antiviral genlerin (örneğin IL-6, TNF ve içinde transkripsiyonel aktivasyonu sağlar945;, CCL5 ve IFNβ). Bu sinyal cascades enfeksiyonunun erken safhaları sırasında patojen yayılma sınırlamak için, bir anti-mikrobiyal devlet kurmak etkili iç doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini oluşturmaktadır.

Murin γHV68 yakın insan onkojenik KSHV ve EBV ile ilgilidir. Böylece, farelerin γHV68 enfeksiyonu in vivo 7 gamma herpes virüs enfeksiyonu bağışıklık tepkisini incelemek için izlenebilir küçük bir hayvan modeli sağlar. ΓHV68 viral enfeksiyon etkinleştirmek için doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyon ev sahipliği hijacks sayede γHV68 kullanarak, bizim laboratuvar karmaşık bir strateji ortaya çıkardı. Bir yandan, γHV68 çoğaltma transaktivatörü (RTA), γHV68 çoğaltma 8 viral transkripsiyon faktörü anahtar fosforile aktif IKKβ yönlendirilmesi ile viral kopyalama aktivasyonunu desteklemek üzere Mavs-IKKβ yolu aktive eder. Öte yandan, IKKβ aracılı fosforilasyonu bozulması ve bir dönem için göreceli hazırlarNFKB aktivasyonunu 9 inates. Bu nedenle, etkili bir anti-viral enfeksiyon γHV68 sitokin üretimini önler. İlginç bir şekilde, γHV68 bir ifade kütüphanesi kullanan bir tarama RelA bozulmasını uyarmak ve NFKB 10 aktivasyonunu ortadan kaldırmak için, bir E3 ligaz gibi RTA tespit edilmiştir. Bu bulgular üst bağışıklık sinyalizasyon olaylar nihai antiviral sitokin üretimini inkâr γHV68 tarafından boyunduruk sayede karmaşık bir bağışıklık kaçırma stratejisi ortaya çıkarmak.

Burada in vivo ve ex viv o iki γHV68 ile enfekte edilmiş farelerdeki antiviral sitokin üretimini ölçmek için bir protokolü tarif eder. Protokolde, bundan başka, anti-viral sitokin üretiminin düzenlenmesinde belirli doğuştan gelen bağışıklık moleküllerin fonksiyonu saptar lentiviral transdüksiyon ile nakavt embriyonik fibroblastlar içinde doğal bağışıklık bileşenlerinin "sulandırılmış" ifade araştırmak. Bu protokol, kolayca diğer Viru uyarlanabilirses ve sinyal yolları.

Protocol

Etik Açıklama: Tüm hayvan çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerilerine sıkı göre altında yapıldı. Protokol Southern California Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1.. ΓHV68 enfeksiyonlu Farelerde ELISA ile kantitatif gerçek zamanlı PCR ve sitokin salgılaması tarafından Gene Expression Periton boşluğu içine ksilazin ket…

Representative Results

Üç örnek şekiller γHV68 enfeksiyonlu Mavs akciğerinde sitokin üretimi de dahil olmak üzere, burada gösterilmektedir + / + ve Mavs-/ – / – – γHV68 enfekte Mavs + / + ve Mavs fare, sitokin salgılama ve gen ekspresyon seviyesi MEF'ler ve γHV68-enfekte Mavs sitokin mRNA seviyeleri – / – MEF'ler Mavs ile "yeniden". Bu örnek deneyler, in vivo olarak anti-viral sitokin üretimini incelemek ve düzenl…

Discussion

Viral bağışıklık kaçırma viral suç ve konak savunmasını 9 arayüz en dinamik ve etkileyici etkileşimleri biridir. Konak doğuştan gelen bağışıklık bileşenlerini sinyal iletimi etkili başlayan ve sadakatle iletilir şekilde yapılandırılmıştır. Kaskadlarını sinyal hiyerarşisini ve düzenleme çizen doğal bağışıklığın bir önde gelen konudur. Burada, sitokin üretiminin viral kaçırma bir doğuştan gelen bağışıklık bileşen, mavs, düzenleyici rolleri belirlemek için b…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yabani-tür (Mavs + / +) ve boşaltma (Mavs – / -) fareler, vahşi tip (Mavs + / +) ve boşaltma (Mavs – / -) MEF'ler nezaketen Dr Zhijian J. Chen (University of tarafından sağlandı Texas Güneybatı Tıp Merkezi) 13.. Bu yayın NIH (R01 ve R01 CA134241 DE021445) ve Amerikan Kanser Derneği (RSG-11-162-01-MPC) hibe ile finanse çalışmalarına dayanmaktadır.

Materials

Mouse CCL5 ELISA kit R&D systems DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads BioSpec Products 11079110z
TRIzol Invitrogen 15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA

References

  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
  2. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunol. Rev. 243, 91-98 (2011).
  3. Kawai, T., et al. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
  4. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122, 669-682 (2005).
  5. Xu, L. G., et al. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling. Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).
  6. Meylan, E., et al. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature. 437, 1167-1172 (2005).
  7. Speck, S. H., Virgin, H. W. Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).
  8. Dong, X., et al. Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication. PLoS Pathog. , (2010).
  9. Dong, X., Feng, P. Murine gamma herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to abrogate NFkappaB activation and antiviral cytokine production. PLoS Pathog. 7, (2011).
  10. Dong, X., et al. Murine gammaherpesvirus 68 evades host cytokine production via replication transactivator-induced RelA degradation. J. Virol. 86, 1930-1941 (2012).
  11. Dong, X., Feng, P. Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus. J. Vis. Exp. , (2011).
  12. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
  13. Sun, Q., et al. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity. 24, 633-642 (2006).

Play Video

Cite This Article
Zhang, J., Zhu, L., Feng, P. Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production. J. Vis. Exp. (85), e51078, doi:10.3791/51078 (2014).

View Video