הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור
Summary
אנו מתארים פרוטוקול למדוד את ייצור ציטוקינים אנטי בעכברים נגועים בוירוס ההרפס מודל, וירוס ההרפס עכברי גמא 68 (γ HV68) הקשור-הדוק לההרפס של קפוסי האנושי הקשורים סרקומה (KSHV) ווירוס אפשטיין בר (EBV). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי וfibroblasts העכבר העוברי (MEFs), אנחנו הערכנו את ייצור ציטוקינים אנטי גם in vivo לשעבר vivo. "בנייה מחדש" את הביטוי של מרכיבי חיסון מולדים בfibroblasts העוברי בנוקאאוט על ידי התמרה lentiviral, אנחנו עוד לאתר מולקולות חיסון מולדים ספציפיות ולנתח את אירועי איתות מפתח שדיפרנציאלי להסדיר את ייצור ציטוקינים אנטי.
Abstract
בתגובה לזיהום נגיפי, התגובה החיסונית המולדת המארח מופעלת כדי למעלה לווסת ביטוי גנים וייצור של ציטוקינים אנטי. לעומת זאת, וירוסים התפתחו אסטרטגיות מורכבות להתחמק ולנצל את איתות חיסונית מארחת להישרדות ולרבייה. התחמקות חיסונית נגיפית, כרוך הגנת מארחת והעלמת נגיפית, מספקת את אחד הממשקים המרתקים ודינמיים ביותר להבחין באינטראקציה מארח וירוס. מחקרים אלה מקדמים את ההבנה שלנו בויסות מערכת החיסונית מולדת ולסלול את הדרך שלנו לפתח טיפולים אנטי רומן.
Murine γHV68 הוא הפתוגן טבעי של מכרסמים עכבריים. γHV68 זיהום של עכברים מספק מודל חיה קטן צייתן כדי לבחון את התגובה אנטי לKSHV אדם וEBV שהפרעות של in vivo אינטראקציות מארח וירוס אינה ישימות. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לקבוע את ייצור ציטוקינים אנטי. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לvir האחרמשתמש ואיתות מסלולים.
לאחרונה, גילו כי γHV68 חטיפת Mavs וIKKβ, רכיבי מפתח מולדים חיסוניים איתות במורד הזרם של RIG-I cytosolic וMDA5, כדי לבטל את הפעלת NFΚB וייצור ציטוקינים אנטי. באופן ספציפי, זיהום γHV68 מפעיל IKKβ ושIKKβ הופעל phosphorylates רלה להאיץ השפלה רלה. ככזה, HV68 γ יעילות uncouples הפעלת NFΚB מIKKβ הופעל במעלה הזרם שלו, שולל את ביטוי גני ציטוקינים אנטי. מחקר זה מבהיר אסטרטגיה מורכבת לפיה הפעלת מערכת החיסון המולדת במעלה הזרם הוא יורטה על ידי פתוגן ויראלי כדי לבטל את הפעלת תעתיק מורד הזרם המיידית ולהתחמק ייצור ציטוקינים אנטי.
Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה תארו את מפלי איתות הכוללים בהרכבת מערכת חיסונית מולדת מארח. המתגורר בתוך תאים נפרדים, קולטני זיהוי תבניות (PRRs) לזהות דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) ממוצא המגוון כדי לעורר חיסון מולדים איתות 1. הגן רטינואית-Induced חומצתי (RIG-I) ואנטיגן בידול מלנומה 5 חלבונים (MDA5) הם חיישני cytosolic שיכירו מיני RNA עם תכונות מבניות ספציפיות 2. עם ההפעלה, RIG-I אינטראקציה עם Mavs ההמשך שלה (הידוע גם בIPS-1, ויזה, וCARDIF) מתאם זה, בתורו, מפעיל את IKK (IKKαβγ) וקינאז הקשורות IKK (TBK1 וIKKε, הידוע גם Ikki ) קומפלקסי 3-6. קינאזות חיסון המולדת מופעלת phosphorylate רגולטורים מפתח של ביטוי גנים, ובם גורמי שעתוק ומעכביהם, ולאפשר הפעלת תעתיק של גנים אנטי מארח (למשל IL6, TNF & #945;, CCL5, וIFNβ). מפלי איתות אלה מהווים תגובות עוצמה פנימיות מולדת חיסונית שלהקים מדינה אנטי מיקרוביאליים להגביל את התפשטות הפתוגן במהלך של זיהום בשלבים מוקדמים.
Murine γHV68 קשור קשר הדוק לKSHV שעור האדם וEBV. לכן, זיהום γHV68 של עכברים מספק מודל חיה קטן צייתן כדי לבחון את התגובה החיסונית המארחת לזיהום בנגיף הרפס גמא in vivo 7. שימוש γHV68, המעבדה שלנו חשפה אסטרטגיה מורכבת לפי γHV68 חטיפת לארח איתות חיסונית מולדת כדי לאפשר הדבקה בנגיף. מצד אחד, γHV68 מפעיל את מסלול Mavs-IKKβ לקדם הפעלת תעתיק ויראלי באמצעות בימוי IKKβ הופעל לphosphorylate transactivator שכפול (להרכבה עצמית), המפתח גורם שעתוק הנגיפי עבור שכפול γHV68 8. מצד השני, זירחון תיווך IKKβ מספרים ראשוני רלה לשפלה וטווחinates NFΚB הפעלת 9. ככזה, זיהום γHV68 יעיל ימנע ייצור ציטוקינים אנטי. מעניין, הקרנת ניצול ספריית ביטוי של γHV68 זיהתה הרכבה עצמית כאנזים E3 כדי לגרום השפלה רלה ולבטל NFΚB הפעלת 10. ממצאים אלה לחשוף אסטרטגיית התחמקות חיסונית מורכבת לפיה אירועי איתות חיסוניים נגד הזרם הם רתמו על ידי γHV68 לשלול את ייצור ציטוקינים אנטי האולטימטיבי.
כאן אנו מתארים פרוטוקול למדוד את ייצור ציטוקינים אנטי בעכברים נגועים בγHV68 גם in vivo לשעבר ויו o. בפרוטוקול אנחנו עוד לחקור את הביטוי "מחדש" של רכיבים חיסוניים מולדים בfibroblasts העוברי בנוקאאוט על ידי התמרה lentiviral, אשר מאתרת את הפונקציה של מולקולות חיסון המולדים הספציפיות בויסות ייצור ציטוקינים אנטי. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לviru האחרses ומסלולי איתות.
Protocol
Representative Results
Discussion
התחמקות חיסונית נגיפית היא אחת האינטראקציות דינמיות ומרתקות ביותר התממשקות עבירה נגיפית ומארח הגנה 9. מרכיבי החיסון המולדים המארח בנויים כך שהולכים אותות הוא יזם ביעילות ובמועבר בנאמנות. המגדיר את ההיררכיה ופיקוח על איתות מפלים הוא נושא בולט של חסינות מולדת. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עכברים, wild-type (Mavs + / +) ונוקאאוט (Mavs – / -) wild-type (Mavs + / +) ונוקאאוט (Mavs – – /) MEFs סופקו באדיבות על ידי ד"ר ג 'יי Zhijian חן (אוניברסיטת מרכז טקסס Southwestern Medical) 13. פרסום זה מבוסס על מומנה על ידי מענקים מ-NIH (R01 CA134241 וR01 DE021445) ואגודה האמריקנית לסרטן (RSG-11-162-01-MPC) עבודה.
Materials
References
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunol. Rev. 243, 91-98 (2011).
- Kawai, T., et al. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122, 669-682 (2005).
- Xu, L. G., et al. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling. Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).
- Meylan, E., et al. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature. 437, 1167-1172 (2005).
- Speck, S. H., Virgin, H. W. Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).
- Dong, X., et al. Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication. PLoS Pathog. , (2010).
- Dong, X., Feng, P. Murine gamma herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to abrogate NFkappaB activation and antiviral cytokine production. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Dong, X., et al. Murine gammaherpesvirus 68 evades host cytokine production via replication transactivator-induced RelA degradation. J. Virol. 86, 1930-1941 (2012).
- Dong, X., Feng, P. Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus. J. Vis. Exp. , (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
- Sun, Q., et al. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity. 24, 633-642 (2006).
