Summary

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em> Drosophila</em> Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Published: April 24, 2013
doi:

Summary

Burada dopaminerjik (DA) nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kurulmuştur iki deneyleri tarif<em> Drosophila</em>: Tırmanma / DA nöronları dejenerasyon ve tüm beyin bağlar DA nöronlar belirlemek ve saymak için kullanılan tirozin hidroksilaz immün işlevsel etkilerini incelemek için izin verir irkilme-kaynaklı negatif geotaxis testi.

Abstract

Drosophila melanogaster sinir sisteminde yaşlanma ve patolojik dejeneratif süreçleri incelemek için değerli bir model organizmadır. Deneysel bir sistem olarak sinek avantajları kendi genetik tractability, kısa yaşam süresi ve gözlemlemek ve kantitatif karmaşık davranışları analiz imkanı içerir. Drosophila beynin belirli bir nöron popülasyonları hastalık bağlantılı genlerin ifadesi, Parkinson ve Alzheimer 5 insan nörodejeneratif hastalıklar modellemek için de kullanılabilir.

Dopaminerjik (DA) nöronlar yaşlanma insan beyninde en savunmasız nöron popülasyonları arasında yer almaktadır. Parkinson hastalığında (PH), en sık görülen nörodejeneratif hareket bozukluğu, DA nöron hızlandırılmış kaybı lokomotor fonksiyon ilerleyici ve geri dönüşü olmayan bir düşüşe yol açar. Yaş ve çevresel toksinler ek olarak, DA nöronların kaybı kodlama spesifik mutasyonlar şiddetlenirçeşitli genlerin veya organizatörü bölgeleri. Örneğin PD-ilişkili alellerinin belirlenmesi in vivo DA nöronların nörodejenerasyon incelemek için bir model olarak Drosophila kullanımı için deneysel olarak içerir. Örneğin, Drosophila DA nöronlar özetler, insan hastalığı bazı özellikleri, DA nöronların sürekli bir şekilde azalması gibi ve azalan lokomotor fonksiyonunu 2 PD-bağlantılı insan α-sinüklein geninin ifadesi. Buna göre, bu model başarılı PH 8 potansiyel terapötik hedefleri tespit etmek için kullanılmıştır.

Tüm yetişkin beyin irkilme-kaynaklı olumsuz geotaxis tepki ve tirozin hidroksilaz immün dayalı bir tırmanma testi DA nöron sayısı izlemek için bağlar: Burada sık Drosophila DA nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kullanılmıştır iki deneyleri tarif farklı yaşlarda. Her iki durumda da, UAS t in vivo sentezlenmesiniDA spesifik nöronlarda ransgenes bir tirosin hidroksilaz (TH) promotör-Gal4 sürücüsü satır 3, 10 kullanılarak elde edilebilir.

Introduction

Burada açıklanan testlerin özgüllüğü dopaminerjik nöronların 3 spesifik ekspresyon elde etmek için tirozin hidroksilaz geninin düzenleyici sekansları yararlanan bir Gal4 sinek hattının kullanımına dayanır. Tirozin hidroksilaz, dopamin sentezinde ilk ve oran-sınırlayıcı aşama katalize eder. In vivo DA nöronların (örnek 6 bakınız) tanımlamak için uygun bir aday TH yapma dopamin ile, o, yetişkin sinek beyin örtüşmekte TH immünoreaktivite. Ayrıca, THGal4 salgılama modelini dopa dekarboksilaz gen ayarlayıcı sıralan içerir ve DA nöronlarda sadece transgenik ekspresyonu sağlayan bu DdcGal4 gibi diğer Gal4 hatları, bu daha spesifik olan, ama aynı zamanda 3 glial hücreler serotonerjik nöronların alt gruplarında .

Feany ve Bender (2000) ilk PD-bağlantılı insan α-sinüklein geninin pan-nöronal ifade sta en ilerici kaybını hızlandırır görülmektedirDrosophila rtle bağlı olumsuz geotaxis davranış. Biz expressionof bir α-sinüklein transgen 10 sürücü DA-nöron spesifik THGal4 satırını kullanarak benzer sonuçlar gözlenmiştir ve bu Nrf2 yolunun nöroprotektif rolünü incelemek için bu fonksiyonel Okuması kullanmış PD 14 Drosophila modeli. Burada açıklanan belirli tahlil 2 ve 3 uyarlanmıştır.

Drosophila beyin (örneğin 11 ve 7 için bakınız) konfokal mikroskopi ile tüm beyin bağlar görselleştirilebilir en az 5 farklı topakçıklar halinde düzenlenmiş olan birden fazla 100 da nöronlar (PPL1, PPL2, PAL PPM1 / 2, PPM3) içerir. Ancak, yaşa bağlı nörodejenerasyon PD-bağlantılı genler mutasyona uğramış nerelerde sinekler gözlenen / insan hastalıkları modellemek için aşırı eksprese değil, 9 yaşında, 11 ile Drosophila beyin düşüşler DA nöron sayısı olup olmadığını hala tartışmalıdır5. DA nöronlarda insan α-sinüklein ifadesi gibi bir etkisi vardır ve bu nedenle, PD için bir model olarak kullanılmıştır. Burada DA nöronlar hücre belirteci olarak TH kullanarak bağlar tüm beyin saymak için bir test tarif. Bu deney, 13 ve 10 den adapte edilmiştir.

Protocol

1. Irkilme indüklenen Negatif Geotaxis Testi Istenen genotip sinekler seçin, onları 20-30 hayvan kohortlarında grup rastgele, cinsiyete göre ayırın ve 2-3 günde bir yeni gıda şişeleri içine çevirmek, test sinekler her set (yani yaş olarak eşleştirilmiş kohort, bir kohort / genotip) haftada en az bir kez. Olumsuz geotaxis test öncesi otuz dakika, CO 2 sinekler uyutmak ve iki boş gıda şişeleri (Malzeme Tablo) (oda boyutları net bir bant ile a…

Representative Results

Bu tahliller PH 14 bir Drosophila modelinde stres koruyucu Nrf2 yolunun rolünü incelemek için burada açıklanan kullandık. Bu model, bir TH Gal4 sürücü 2, 10 ile DA nöronlarda insan α-sinüklein geninin ifadesini dayanır. Şekil 1 TH Gal4 sürücünün kontrolü altında farklı transgenlerin ifade erkek sinekler bir irkilme-kaynaklı negatif geotaxis (tırmanma) testinin temsili bir sonuç göstermektedir. Tüm genotipler zamanla lo…

Discussion

Deneyleri farklı hastalık bağlı genetik arka (5 yorumlanan) yanı sıra yaşlanma DA nöronların bakım yolları veya küçük bileşikleri sinyal, belirli genlerin rolü incelemek için yararlı bir yaklaşım sağlamak Burada anlatılan.

Drosophila irkilme indüklenen Negatif geotaxis davranış bu yöntem özellikle PD-bağlantılı mutasyonlar varlığında farklı genetik arka bölgesi DA nöronların işlevselliği için Okuması işlevsel olarak kullanılmış…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz yararlı tartışmalar için teknik yardım ve Gerasimos P. Sykiotis için, sinek hisse senetleri için Christine Sommers Leo Pallanck teşekkür ederim. Bu çalışma MCB için NIH eğitim bursu T32CA009363 tarafından finanse edildi

Materials

Name Company Catalogue number Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody Millipore AB152  
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody Jackson ImmunoResearch 711-026-152  
Mowiol Calbiochem 475904  
DABCO Sigma D2522  
      Equipment
Polystyrene vials VWR 89092-734 28.5 x 95 mm
Digital camera Canon PowerShot A3100IS (model) 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5 VWR 48366 205 48393 252 Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2 VWR 48368-040 Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes Electron Microscopy Sciences 70543-01 Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers Electron Microscopy Sciences 72705-01  
Stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000 (model)  
Confocal microscope Leica SP2 or SP5 (model)  

Materials Table.

References

  1. Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).
  2. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson’s disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
  3. Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase. J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).
  4. Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
  5. Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).
  6. Lundell, M., Hirsh, J. Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS. Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).
  7. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
  8. Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson’s Disease and Related Synucleinopathies. Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).
  9. Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster. Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).
  10. Trinh, K., Moore, K., et al. Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson’s disease. J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).
  11. White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
  12. Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson’s disease. Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).
  13. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
  14. Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).

Play Video

Cite This Article
Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining. J. Vis. Exp. (74), e50339, doi:10.3791/50339 (2013).

View Video