Summary

הערכת פנוטיפים ניווניות ב<em> דרוזופילה</em> נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

Published: April 24, 2013
doi:

Summary

כאן אנו מתארים שני מבחני שנקבעו ללמוד ניוון מוחיים תלוי גיל של דופאמין (DA) בנוירונים<em> דרוזופילה</em>: הטיפוס / assay geotaxis השלילי הנגרם בהלה המאפשר ללמוד את ההשפעות הפונקציונליות של תאי עצב וניוון DA immunostaining hydroxylase טירוזין המשמש לזיהוי וספירת תאי עצב DA בmounts כל המוח.

Abstract

תסיסנית היא אורגניזם מודל חשוב ללמוד הזדקנות ותהליכים ניווניים פתולוגיים במערכת העצבים. היתרונות של הזבוב כמערכת ניסיונית כוללים עקיבותיה גנטיות, תוחלת חיים קצרה ואת האפשרות להתבונן ולנתח כמותית התנהגויות מורכבות. הביטוי של גני מחלה צמודים באוכלוסיות עצביות מסוימות במוח דרוזופילה, יכול לשמש מודל למחלות אנושיות ניווניות כגון פרקינסון ואלצהיימר 5 של.

דופאמין (DA) נוירונים הם בין האוכלוסיות העצביות הפגיעות ביותר במוח האנושי ההזדקנות. במחלת הפרקינסון (PD), ההפרעה בתנועת ניווניות השכיחה ביותר, האובדן המואץ של תובע הנוירונים מוביל לירידה הדרגתית ובלתי הפיכה בתפקוד של תנועה. בנוסף לגיל וחשיפה לרעלים סביבתיים, אובדן DA נוירונים מחריף על ידי מוטציות ספציפיות בקידודאזורי האמרגן או של מספר גנים. זיהוי אללים כאלה PD-נלווים מספק את הבסיס הניסיוני לשימוש בדרוזופילה כמודל ללמוד ניוון מוחיים של נוירונים DA in vivo. לדוגמה, הביטוי של גן α-synuclein האנושי פ"ד הצמוד בתסיסנית משחזר DA נוירונים תכונות מסוימות של המחלה בבני האדם, למשל אובדן הדרגתי של נוירונים DA ותפקוד של תנועה 2 במגמת ירידה. בהתאם לכך, מודל זה שימש בהצלחה לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות בפ"ד 8.

כאן אנו מתארים שני מבחני שיש בדרך כלל נעשה שימוש כדי ללמוד ניוון מוחיים תלוי גיל של נוירונים DA בדרוזופילה: assay טיפוס המבוסס על התגובה הנגרמת בהלה השלילית geotaxis וimmunostaining hydroxylase טירוזין של כל המוח בוגר mounts כדי לפקח על מספר הנוירונים DA בגילים שונים. בשני המקרים, בביטוי vivo של כטב"מ לאransgenes במיוחד בנוירונים DA יכול להיות מושגת על ידי השימוש בhydroxylase טירוזין (TH) אמרגן Gal4 קו נהג 3, 10.

Introduction

את הספציפיות של מבחני המתוארות כאן מסתמכת על השימוש בקו זבוב Gal4 המנצל את רצפי הרגולטורים של גן hydroxylase טירוזין כדי להשיג ביטוי ספציפי בדופאמין נוירונים 3. hydroxylase טירוזין מזרז את הצעד הראשון ושער הגבלת בסינתזת דופמין. immunoreactivity בעולם בחופף במוח זבוב בוגר עם זה של דופמין, מה שהופך TH מועמד טוב לזהות נוירונים DA in vivo (ראה, למשל, 6). יתר על כן, את דפוס הביטוי של THGal4 הוא יותר ספציפי מזה של Gal4 קווים אחרים כגון DdcGal4, המכיל רצפים רגולטוריים מגן decarboxylase dopa ומניע את הביטוי מהונדס לא רק בתאי עצב DA, אלא גם בתאי עצב serotoninergic ותת קבוצות של תאי גלייה 3 .

Feany והנדר (2000) נצפו לראשונה כי ביטוי הפאן עצבי של גן פ"ד הצמוד האנושי α-synuclein מאיץ את האובדן ההדרגתי של STAהתנהגות geotaxis שלילית מושרה rtle בדרוזופילה. יש לנו נצפתה תוצאות דומות באמצעות THGal4 הקו הספציפי DA-נוירון לנהוג expressionof α-synuclein transgene 10 והשתמשה בזה תפקודי קריאה החוצה כדי ללמוד את תפקיד neuroprotective של מסלול Nrf2 בזה מודל של דרוזופילה פ"ד 14. Assay הספציפי המתוארים כאן הוא עיבוד 2 ו -3.

מוח תסיסנית מכיל יותר מ -100 נוירונים DA, מסודרים בלפחות 5 אשכולות שונים (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) אשר יכולה להיות דמיינו בmounts כל המוח על ידי מיקרוסקופיה confocal (ראה למשל 11 ו -7). זה עדיין שנוי במחלוקת או לא מספר הנוירונים DA בירידות במוח תסיסנית עם גיל 9, 11, עם זאת, ניוון מוחיים תלוי גיל הוא ציין בזבובים שבו גני פ"ד צמודים כבר מוטציה / overexpressed למודל מחלות אנושיות5. הביטוי של אדם α-DA synuclein בנוירונים יש השפעה כזו, ולכן, כבר משמש כמודל למחלת פרקינסון. כאן אנו מתארים assay לנוירונים DA לספור במוח כולו עולה באמצעות TH כסמן תא. assay זה הותאם מ -13 ו -10.

Protocol

1. Assay geotaxis השלילי הנגרם בהלה בחר זבובים של הגנוטיפ הרצוי, להפריד ביניהם על פי מין, באופן אקראי קבוצתם בקבוצות של 20-30 חיות ולהעיף אותם לתוך צלוחיות מזון חדשות כל 2-3 ימים; בדיקה כל קבוצה של זבובים (קבוצות גיל בהתאמה כלומ?…

Representative Results

יש לנו בשימוש במבחנים שתוארו כאן כדי ללמוד את התפקיד של מסלול Nrf2 מגן מתח במודל של דרוזופילה פ"ד 14. מודל זה מסתמך על הביטוי של גן α-synuclein האנושי בנוירונים תובע באמצעות Gal4 נהג TH 2, 10. איור 1 מראה תוצאת נציג ש?…

Discussion

מבחני מתוארים כאן לספק גישה כדאי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים, מסלולי איתות או תרכובות קטנות בתחזוקה של נוירונים תובע בהזדקנות, כמו גם ברקע גנטי הקשורים למחלות שונות (הנסקרת ב 5).

התנהגות geotaxis השלילית הנגרמת בהלה של דר?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לליאו Pallanck למניות זבובים, כריסטין סומרס לקבלת סיוע טכני וגרסימוס פ Sykiotis לדיונים מועילים. עבודה זו מומנה על ידי NIH אימוני המענק T32CA009363 לMCB

Materials

Name Company Catalogue number Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody Millipore AB152  
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody Jackson ImmunoResearch 711-026-152  
Mowiol Calbiochem 475904  
DABCO Sigma D2522  
      Equipment
Polystyrene vials VWR 89092-734 28.5 x 95 mm
Digital camera Canon PowerShot A3100IS (model) 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5 VWR 48366 205 48393 252 Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2 VWR 48368-040 Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes Electron Microscopy Sciences 70543-01 Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers Electron Microscopy Sciences 72705-01  
Stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000 (model)  
Confocal microscope Leica SP2 or SP5 (model)  

Materials Table.

References

  1. Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).
  2. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson’s disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
  3. Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase. J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).
  4. Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
  5. Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).
  6. Lundell, M., Hirsh, J. Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS. Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).
  7. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
  8. Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson’s Disease and Related Synucleinopathies. Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).
  9. Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster. Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).
  10. Trinh, K., Moore, K., et al. Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson’s disease. J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).
  11. White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
  12. Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson’s disease. Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).
  13. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
  14. Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).

Play Video

Cite This Article
Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining. J. Vis. Exp. (74), e50339, doi:10.3791/50339 (2013).

View Video