Summary

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

Published: June 23, 2013
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Summary

L'articolo descrive un semplice facilmente adattabile<em> In vitro</em> Modello per studiare la polarizzazione dei macrofagi. In presenza di GM-CSF/M-CSF, cellule staminali / progenitrici ematopoietiche del midollo osseo sono dirette nella differenziazione monocitica, seguita dall'attivazione M1 o M2. Lo stato di attivazione può essere seguita da cambiamenti antigeni di superficie cellulare, espressione genica e le vie di segnalazione cellulare.

Abstract

L'articolo descrive un adattamento prontamente semplice modello in vitro per studiare la polarizzazione dei macrofagi. In presenza di GM-CSF/M-CSF, cellule staminali / progenitrici ematopoietiche del midollo osseo sono dirette nella differenziazione monocitica, seguita dall'attivazione M1 o M2. Lo stato di attivazione può essere seguita da cambiamenti antigeni di superficie cellulare, espressione genica e le vie di segnalazione cellulare.

Introduction

Distinto da risposte infiammatorie classiche, macrofagi che infiltrano i tessuti spesso mostrano lo stato di attivazione polarizzato che gioca un ruolo cruciale nella regolazione delle funzioni fisiologiche del tessuto ospite 1-8. Dopo la stimolazione, l'attivazione dei macrofagi possono essere ordinati in classic (M1) e alternativi (M2) attivazione 2, 4, 9. Attivazione dei macrofagi M1 dipende da recettori Toll-like (TLR) e l'attivazione del fattore nucleare kappa B (NFκB) / c-Jun N-terminal chinasi 1 (JNK1), che porta alla produzione di citochine infiammatorie, come TNF-α e IL- 1β e l'attivazione di iNOS che si traduce in un aumento della produzione di specie reattive come ossido di nitruro (NO) 10, 11. In contrasto, M2 macrofagi attivazione reclute PPARy, PPARδ, o IL-4-STAT6 percorsi, portando a antinfiammatorio attivazione alternativa, (M2) che è associato con sovraregolazione di mannosio recettore CD206, e arginasi 1 (Arg1) 6, 12 – 14 </ Sup>.

Midollo osseo macrofagi derivati ​​(BMDM) presentano un ideale modello in vitro per capire i meccanismi che controllano la polarizzazione dei macrofagi attivati ​​15. Specificamente, l'attivazione dei macrofagi M1 può essere indotta da lipopolisaccaridi (LPS) stimolazione, mentre la polarizzazione dei macrofagi M2 può essere indotta da IL-4 e / o IL-13. Mature del midollo osseo macrofagi derivati ​​e macrofagi attivati ​​possono essere identificati attraverso l'analisi di citometria a flusso per l'espressione di antigeni di superficie, tra cui CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 e CD86 9, 16, 17. Inoltre, i cambiamenti nella produzione di citochine e di vie di segnalazione cellulari connessi con polarizzazione dei macrofagi possono essere misurati mediante RT-PCR e western blotting, rispettivamente. In sintesi, il midollo osseo del topo macrofagi derivati ​​possono servire da modello rilevante per studiare polarizzazione dei macrofagi in vitro.

Protocol

1. Isolamento di cellule del midollo osseo Isolare femore e tibia ossa di 6-8 settimane di età i topi, risciacquare i capelli e poi tagliare aprire l'osso. Utilizzare un ago 21G e siringa da 10 ml per scovare midollo in PBS freddo +2% inattivato con il calore siero bovino fetale (FBS) (3-5 ml / mouse). Passare osseo attraverso un ago 21G 4-6 volte dissociare le cellule. Passate le cellule attraverso un colino cellula 70 micron per rimuovere grumi di cellule, ossa, capelli e …

Representative Results

Una descrizione schematica del procedimento BMDM generazione è presentato (Figura 1). Elevata purezza dei macrofagi maturi può osservare il giorno 7, quando rappresentano il 95 al 99% di CD11b + F4/80 + cellule (Figura 2). Macrofagi polarizzati possono essere esaminati utilizzando anticorpi contro CD11b, F4/80, CD11c e CD206 seguiti da analisi di citometria a flusso. Come mostrato in figura 3, i macrofagi M1 vengono rilevati come CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-cellule …

Discussion

Riportiamo qui una procedura semplice e facilmente adattabile in vitro per indurre attivazione dei macrofagi derivati ​​da midollo osseo cellule progenitrici. Questa procedura può essere utilizzata per le indagini di meccanismi responsabili per la polarizzazione dei macrofagi. La purezza dei macrofagi maturi ottenuti usando questo protocollo medie 95-99%, e non necessita di ulteriori procedure di purificazione. Per studiare la funzione dei geni specifici di interesse nel contesto di polarizzazione macrofag…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (BGIA 7.850.037 al dottor Beiyan Zhou).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
IMDM Thermo Scientific SH30259.01
Fetal bovine serum Invitrogen 10438-026
Murine GM-CSF PeproTech 315-03
NH4Cl StemCell Technologies 7850
L-929 ATCC CCL-1
70 μm cell strainer BD Biosciences 352350
10 x PBS Thermo Scientific AP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APC eBioscience 17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITC eBioscience 11-4801-81
Anti-mouse CD69-PE eBioscience 12-0691-81
Anti-mouse CD86-PE eBioscience 12-0862-81
Propidium Iodine Invitrogen P3566

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Cite This Article
Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).

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