Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

Il est bien connu que les neurones matures dans le système nerveux central (SNC) ne peuvent se régénérer leurs axones après des blessures dues à la capacité intrinsèque diminuée pour soutenir la croissance des axones et un environnement hostile dans le ^1,2 matures du SNC. En revanche, les neurones matures dans le système nerveux périphérique (SNP) de régénérer rapidement après les blessures ^3. Adultes dorsales profondes ganglionnaires (DRG) neurones sont bien connus pour régénérer vigoureusement après lésions des nerfs périphériques. Chaque neurone DRG pousse un axone du soma des cellules, qui se divise en deux branches: une branche axonale périphérique innervant cibles périphériques et une branche centrale se prolongeant dans la moelle épinière. Blessures des résultats DRG axones périphériques dans la régénération des axones substantielle, alors que les axones centraux dans la moelle épinière régénérer mal après la blessure. Toutefois, si la lésion périphérique axonale se produit avant la lésion de la moelle épinière (un processus appelé la lésion conditionné), la régénération des axones centraux est greatly améliorée ^4. En outre, les axones des neurones centraux DRG partager le même environnement hostile comme descendant des axones cortico dans la moelle épinière. Ensemble, on fait l'hypothèse que les mécanismes moléculaires contrôlant la régénération des axones des neurones DRG adultes peuvent être exploitées pour améliorer la régénération des axones du SNC. En conséquence, adultes neurones DRG sont maintenant largement utilisé comme un système modèle pour étudier la croissance des axones régénérative ^5-7.

Ici, nous décrivons une méthode d'adultes DRG neurone culture qui peut être utilisé pour l'étude génétique de la régénération des axones in vitro. Dans ce modèle adulte neurones DRG sont génétiquement manipulés par électroporation à médiation transfection du gène ^6,8. Par transfection neurones avec l'ADN plasmidique ou si / shRNA, cette approche permet à la fois à gain et la perte de fonction des expériences pour étudier le rôle de n'importe quel gène d'intérêt dans la croissance axonale des neurones DRG adultes. Lorsque les neurones sont transfectées avec si / shRNA, la protéine endogène ciblée estgénéralement épuisés après 3-4 jours de culture, au cours de laquelle la croissance axonale temps robuste a déjà eu lieu, ce qui rend les études de perte de fonction moins efficace. Pour résoudre ce problème, la méthode décrite ici comprend une étape de remise en suspension et de re-placage après la transfection, les axones qui permet de repousser à partir de neurones dans l'absence de la protéine ciblée. Enfin, nous donnons un exemple d'utilisation de ce modèle in vitro pour étudier le rôle d'une régénération des axones gène associé à, c-Jun, dans la médiation de la croissance des axones des neurones de l'adulte DRG ^9.