교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구
Summary
<em> 체외에서</em교양 성인 마우스 지느러미 루트 신경절의 신경 세포를 사용하여 축삭 재생의 유전자 연구> 모델이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 조작을받은 뉴런의 축삭의 재 성장을 허용하는 re-suspension/re-plating 단계를 포함합니다. 이 방법은 RNAi 기반의 단백질 분해를 사용하여 축삭 재생의 손실 기능 연구에 특히 유용합니다.
Abstract
이곳은 중추 신경계 (CNS)에서 성숙한 뉴런이 성숙 CNS의 1,2의 축삭의 성장과 적대적인 환경을 지원하는 줄었 본질적인 기능으로 인해 부상 후 자신의 axons을 다시 생성 수 없다고 알려져있다. 반대로, 말초 신경 계통의 성숙한 뉴런 (PNS)는 부상 3 후 즉시 재생. 성인 지느러미 루트 신경절 (DRG) 뉴런이 잘 말초 신경 부상 후 robustly 재생하는 것으로 알려져 있습니다. 주변 목표 및 척수쪽으로 뻗어 있고 중앙 지점 innervating 말초 지점 : 각 DRG 신경 세포는 세포 소마의 어느 지점이 axonal 가지로 하나 축삭을 자랍니다. 실질적인 축삭 재생의 DRG 주변 axons 결과의 부상은 척수 중앙 axons 반면 부상 이후 저조한 재생. 주변 axonal 부상 척수 부상 (프로세스 조절 장애라고도 함), 중앙 axons의 중생 이전에 발생하는 경우에는 greatl입니다y는 4 개선. 또한, DRG 뉴런의 중심 axons은 척수에 corticospinal의 axons 내림차순 같은 적대적인 환경을 공유할 수 있습니다. 함께, 그것은 성인 DRG의 신경 세포의 축삭 재생을 제어하는 분자 메커니즘은 CNS의 축삭 재생을 향상시키기 위해 무력화 할 수있는 가상있다. 그 결과, 성인 DRG의 뉴런은 현재 폭넓게 재생 축삭의 성장은 5-7 공부를 모델 시스템으로 사용됩니다.
여기에서 우리는 체외에서 축삭 재생의 유전 연구에 사용할 수있는 성인 DRG 신경 세포 문화의 방법을 설명합니다. 이 모델의 성인에서는 DRG의 신경 세포는 유전자 electroporation-매개 유전자 transfection 6,8 통해 조작됩니다. DNA를 플라스미드 또는시 / shRNA, 이러한 방식은 성인 DRG의 뉴런의 축삭의 성장에있는 유전자의 이익의 역할을 조사하기 위해 모두 이득과 손실 함수 실험을 수있는 뉴런을 transfecting함으로써. 뉴런은시 / shRNA으로 transfected 때, 타겟 내생 단백질입니다일반적으로 손실 기능 연구가 덜 효과적으로 만드는, 시간 강력한 축삭의 성장 이미 문제가 발생한 기간 동안 문화 3-4일, 후에 고갈. 이 문제를 해결하기 위해서 여기 설명한 방법은 axons가 타겟 단백질의 부재에있는 뉴런에서 다시 성장할 수 있도록 transfection 후 다시 중지하고 다시 도금 단계가 포함되어 있습니다. 마지막으로, 우리는 성인 DRG 뉴런 9 축삭의 성장을 중재로 축삭 재생 – 관련 유전자, C-6월의 역할을 공부 체외 모델에서 이것을 사용하는 예제를 제공합니다.
Protocol
Discussion
성인 DRG의 뉴런 이렇게 어른 동물로 축삭 재생을 연구하는 유용한 시스템을 제공 robustly 생체내 및 시험 관내에서 말초 신경 손상 후 자신의 axons을 다시 생성. 성인 DRG의 신경 세포의 체외 배양에서 분자 메커니즘을 조사하기 위해 널리 사용되는 방법이되고있는 작품 축삭 재생이 규제된다. culturing 성인 마우스 DRG 뉴런의 체외 프로 시저에 현재 재생 축삭 성장의 신속하…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH (R01NS064288)와 크레이그 H. Neilsen 재단 FZ의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 |
| Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
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