Intravital Mikroskopi av mjälte: Kvantitativ analys av Parasit Rörlighet och blodflöde
Summary
Vi visar metoden för att utföra intravital mikroskopering av mjälte med GFP transgena malariaparasiter och kvantifiering av parasiten rörlighet och blodflödet i detta organ.
Abstract
Tillkomsten av intravital mikroskopi i experimentella modeller gnagare malaria har gjort stora framsteg i kunskapen om parasit-värd interaktioner 1,2. Därmed har in vivo imaging av malariaparasiter under pre-erytrocyt steg avslöjade aktiva ingången av parasiter i noderna huden lymfkörtlar 3, den fullständiga utvecklingen av parasiten i huden 4, och bildandet av en hepatocyte som härrör merosome att försäkra migration och utsläpp av merozoites i blodet 5. Dessutom har utvecklingen av enskilda parasiter i erytrocyter har nyligen dokumenterats med hjälp av 4D avbildning och utmanade vår nuvarande syn på protein export i malaria 6. Därför har intravital imaging förändrats radikalt vår syn på viktiga händelser i Plasmodium utveckling. Tyvärr studier av dynamiska passage av malariaparasiter genom mjälten, en stor lymfoida organ anpassas vackert att rensa infekterade röda bLood celler saknas på grund av tekniska begränsningar.
Använda mus modell av malaria Plasmodium yoelii i BALB / c möss har vi genomfört intravital avbildning av mjälte och rapporterade en differentiell omdaning av den och följsamhet av parasiterade röda blodkroppar (pRBCs) till barriär celler fibroblastic ursprung i den röda massan under infektion med icke-dödliga parasiten line P.yoelii 17x till skillnad från infektioner med P.yoelii 17XL dödliga parasiten rad 7. För att nå dessa slutsatser, var en särskild metod med ImageJ fri programvara utvecklas för att möjliggöra karakterisering av snabba tredimensionella rörelse enda pRBCs. Resultat som erhållits med det här protokollet kan bestämma hastighet, riktning och uppehållstid av parasiter i mjälten, alla parametrar med inriktning på följsamhet in vivo. Dessutom rapporterar vi metoden för blodflödet kvantifiering med hjälp av intravital mikroskopi och användning av olikaolika färgämnen att få insikt i den komplexa mikrocirkulationen strukturen av mjälte.
Etik uttalande
Alla djurförsök utfördes på djuret faciliteterna på universitetet i Barcelona i enlighet med riktlinjer och protokoll har godkänts av den etiska kommittén för djurförsöksnämnden vid universitetet i Barcelona CEEA-UB (protokoll nr DMAH: 5429). Kvinna BALB / c möss av 6-8 veckors ålder erhölls från Charles River Laboratories.
Protocol
Discussion
Genomförandet av intravital mikroskopi av mjälte i denna gnagare malaria modell öppnat möjligheten att undersöka den dynamiska passage av parasiter genom detta organ som hittills ansetts vara en "black-box" på grund av tekniska överväganden. Här inne var en stor insats sätter att anpassa en kvantitativ metod som tillåter jämförande analys av olika parasit rader vid enstaka och befolkning nivåer. I motsats till andra vävnader och celler som hade avbildad tidigare i malaria 3,5 behöver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är särskilt tacksamma mot S. Graewe och V. Heussler för grundutbildning och kontinuerlig inmatning i intravital mikroskopi av malariaparasiter, till J. Burns för att donera GFP transgena parasiter, till A. Bosch (Confocal Unit, CCIT-UB, IDIBAPS) för att få hjälp inom bildanalys och kvantifiering och P. Astola för tekniskt stöd. Vi tackar R. Tous och jag Caralt för videoproduktion. MF är mottagare av en examen stipendium från det generella i Katalonien. HAP är en ICREA forskning professor. Arbete i laboratorium HAP finansieras av Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr 242.095, av de privata stiftelsen Cellex (Katalonien, Spanien), och av det spanska ministeriet för vetenskap och innovation ( SAF2009-07.760).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites–recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. . The complete spleen. , (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
